三种TAK1剪接异构体的克隆及其在T细胞中的表达和定位研究

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本文通过RT-PCR获得Jurkat T细胞的总cDNA,然后以其为模板,利用特异引物PCR克隆其中TAKl异构体,从7轮筛选中挑了共180个菌落,有138个阳性菌落,其中鉴定为A的有126个(91.3%),B有6个(4.35%),D有6个(4.35%),但没有克隆到C异构体。进一步构建了它们的EYFP和Flag标记的融合蛋白表达载体。 其次,利用Western技术检测了A、B、D三种异构体在293T细胞内的表达情况,发现所有三种异构体都有两条大小相差约10KD的特异的蛋白条带。 然后,利用免疫染色和共聚焦显微技术研究了EYFP和Flag标记的三种TAKl异构体的融合蛋白在未刺激状态下的Jurkat T细胞和293T细胞中的定位,确定了在未刺激状态下TAlKl A、B、D三种异构体都是定位在细胞质内的。 最后,结合生物信息学的分析手段,对实验结果进行了初步分析,推论在TCR信号通路被激活的状态下,TAKl A、B、D三种异构体在T细胞内具有不同的转位,其中A和B两异构体会从细胞质内转位到细胞膜上与TRAF2/6结合,并被磷酸化,随后它们一起转移到细胞质中,TAKl在细胞质中被激活,而对于D异构体则没有此转位的过程。
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