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肿瘤靶向性治疗药物的成功发展在某种程度上依赖于治疗药物的位点特异性输送和被输送药物的生物活性。单抗一直被用来给予其他无选择性的细胞毒药物诸如毒素、放射性核素的选择能力。但是单抗的大分子使其在实际应用中受到诸多限制。来源于小鼠的单克隆抗体3G11具有特异性结合Ⅳ型胶原酶的特性，以其为基础构建导向药物取得了较好的疗效。为了获得更加小型化的抗体片段和肿瘤靶向性免疫治疗药物，本研究分别构建了抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11的单链抗体及单域抗体与力达霉素的基因工程融合蛋白，并分别对它们的活性进行了系列研究。 一、抗Ⅳ型胶原酶单链抗体3G11-scFv在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究 Ⅳ型胶原酶是肿瘤细胞发生侵袭与转移的重要分子基础，也是抗癌药物的新靶点。本研究首先通过PCR扩增得到单链抗体基因，将其克隆入质粒pET-30（+）中，构建重组表达质粒pET-scFv。经酶切鉴定和序列测定后，将pET-scFv转化入大肠杆菌BL21star（DE3）中，进行诱导表达。经定位分析和Western-blot鉴定，表达产物存在于大肠杆菌不可溶性包涵体中，表达量占全菌总蛋白的30％。在变性条件下对包涵体蛋白进行纯化，并经分步透析复性后，每升发酵液可得到约30mg纯度达95％以上的可溶性活性3G11-scFv蛋白。抗原ELISA结果表明，3G11-scFv对抗原Ⅳ型胶原酶的免疫反应呈阳性，抗体亲和常数为6×107M-1。3G11-scFv还能与肿瘤细胞特异性结合，对KB、H22、Bel-7402和C26等肿瘤细胞均呈阳性免疫反应。在明胶酶谱实验中，单链抗体3G11-scFv表现出对肿瘤细胞分泌的Ⅳ型胶原酶活性强烈的抑制作用，能够使人纤维肉瘤HT-1080细胞和人结肠癌HT-29细胞分泌的Ⅳ型胶原酶负染条带明显减弱，且呈浓度依赖性，而无关抗体抗力达霉素单抗F9则无此作用。Transwell小室模型试验表明，3G11-scFv在体外能明显抑制肿瘤细胞的侵袭，抑制程度与浓度呈依赖关系。此外，3G11-scFv静脉注射对小鼠移植性肝癌22有中度抑制作用。