【目的】猪圆环病毒(PCV)分两个血清型PCV1和PCV2。PCV2与猪群中发生的多种疾病有关,其中断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)危害最为严重,给各国养猪业造成了巨大损失。因此,探讨PCV2的致病机理对于PCV2相关疾病的防治具有重要意义。本研究通过分离株PCV2-DT接种健康仔猪尝试复制PMWS病例,以虫荧光素酶为报告基因进行PCV2的Rep、Cap启动子定位,Rep启动子上类干扰素刺激应答元件(vISRE)功能分析,构建PCV2感染性克隆及带HA-Tag的重组PCV2,为研究PCV2的体外增殖与致病性、致病机理以及疫苗研发、分子诊断研究等奠定基础。【方法】(1)用PK-15细胞从东台市某猪场病料中分离获得PCV2-DT毒株,进行其基因组序列分析,并接种病毒于42日龄健康仔猪(无PCV1、PPV、PRV、PRRSV等感染)进行感染试验。(2)用Promotor Prediction软件预测PCV2-DT株的启动子位置,PCR扩增预测启动子片段后定向克隆于pGL3-Basic载体,构建重组载体pGL3-Bp1、pGL3-Bp2、pGL3-Bp3、pGL3-Bp4以及已知序列的PCV1 Rep启动子的重组载体pGL3-Bp5,各重组质粒分别转染PK-15细胞后,以Luciferase Assay System测定各预测启动子片段活性的有无及强弱。(3)将含PCV1和PCV2 Rep启动子的重组质粒pGL3-Bp5、pGL3-Bp2,以及对PCV2 Rep启动子上vISRE实施定点突变而构建的重组载体pGL3-Bpm,分别转染PK-15细胞,用不同剂量α-IFN刺激后测定启动子的活性变化。(4)将PCV2双拷贝基因正向串联克隆于载体pSK(+),构建重组质粒pSK-2PCV2,转染PK-15细胞,盲传4代后,用RT-PCR和IFA方法检测有无病毒粒子产生。(5)用SOE-PCR方法将HA-Tag基因插入到PCV2 Cap蛋白终止密码子前面,环化扩增的线性病毒基因组(Circo-DNA-HA)后转染PK-15细胞,盲传4代用RT-PCR、IPMA、扩增相应片段测序、血凝试验等方法进行重组PCV2-HA病毒粒子检测及其HA-Tag的稳定性检测。【结果】(1)成功分离到PCV2-DT株,其与国内外35株分离株的同源性均在95%以上,仅存在一些点突变,由进化树可见PCV2各毒株之间没有明显的地域性。PCV2-DT株接种仔猪10d后呈现PMWS症状。(2)初步测定,PCV2 Rep启动子位于1705nt～1968nt,Cap启动子位于834nt～1309nt,且活性均高于对照组的SV40启动子。(3)α-IFN可使各启动子活性受到不同程度地抑制,PCV2 Rep启动子的活性与α-IFN剂量正相关,但不同剂量的α-IFN对PCV1 Rep启动子的活性影响不明显。PCV2 Rep启动子上vISRE实施突变后活性减弱,而且对α-IFN的作用不敏感。无论突变与否,高剂量的α-IFN均对Rep启动子具有极强的抑制作用。(4)pSK-2PCV2转染PK-15细胞,盲传4代后经RT-PCR、IFA检测有病毒粒子产生。(5)Circo-DNA-HA转染PK-15细胞,盲传4代后经RT-PCR、IPMA、克隆测序、血凝试验检测有带HA-Tag的重组PCV2-HA的病毒粒子产生,但该病毒不具有血凝活性。【结论】(1)本次分离的PCV2-DT株与国内外35株分离株同源性均很高,仅存在一些点突变。PCV2-DT能够导致仔猪出现PMWS症状。(2)用虫荧光素酶为报告基因成功地对PCV2 Rep、Cap启动子进行初步定位。(3)α-IFN对PCV Rep启动子的活性具有抑制作用,通过vISRE对病毒复制可能具有调节作用。(4)含PCV2正向串联双拷贝基因组的重组质粒pSK-2PCV2具有感染性,转染PK-15细胞可产生病毒粒子。(5)Circo-DNA-HA具有感染性,转染PK-15细胞可获得带HA-Tag的重组PCV2-HA。