开发安全有效的疫苗是预防传染病爆发的有效手段。由于新型抗原的免疫原性弱,因此佐剂的开发成为了疫苗研发的重点之一。复合佐剂能够同时增强免疫强度和改变免疫类型,已成为疫苗佐剂研发的一大趋势。临床应用的乳液佐剂由于能够诱导良好的体液免疫获得了广泛关注,但不能胞内递送抗原,也无法诱导细胞免疫;而颗粒佐剂可有效被细胞内吞,能诱导良好的细胞免疫,但无法模拟天然病原体的柔性。因此,本论文提出将颗粒引入乳液佐剂中组成复合佐剂,经过合理设计可实现其细胞摄取和细胞内行为研究,从而实现颗粒-乳液复合佐剂的协同增效,并考察颗粒在乳液中的不同分布对免疫机制的影响。论文具体开展的研究工作如下:1.发展壳聚糖基颗粒的制备技术,为颗粒-乳液复合佐剂研究提供多样化的颗粒材料。改进实验室的快速膜乳化-热固化技术、以及开发新型的单相凝胶成球技术,使用壳聚糖温敏水凝胶制备得到了微米级和亚微米级的壳聚糖基颗粒。开发均质-热固化技术、优化壳聚糖-TPP离子胶凝法、优化纳米沉淀法,利用分子间的离子相互作用,制备得到了纳米级的壳聚糖颗粒。对壳聚糖颗粒的粒径大小、均一性、表面电荷以及亲疏水性进行表征,为颗粒引入乳液中构建稳定的颗粒-乳液复合佐剂提供了多样化的颗粒材料。2.将颗粒引入乳液内部,构建颗粒-乳液复合佐剂水包油包颗粒乳液(CSSE),其能模拟病原体的动态内吞过程,实现高效细胞摄取。CSSE乳液能够高效包埋颗粒和抗原。其与细胞膜接触时,外部应力和内部颗粒作用下发生明显形变,呈扁平状,从而增大与细胞膜的接触区域;同时颗粒在CSSE内吞过程中持续暴露以提供足够的摄取信号,从而显著增强抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APCs)的摄取及活化。作为口蹄疫(foot-and-mouth disease virus,FMDV)疫苗佐剂,与商品化疫苗ISA206相比,CSSE乳液能够显著增强体液免疫反应及细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫反应,具有明显的佐剂节省效应,是一种有潜力的、安全有效的兽用疫苗佐剂。3.将颗粒引入乳液界面,构建颗粒-乳液复合佐剂Pickering乳液(CSPE),其具有胞内向高分子稳定乳液转变的特征,实现高效可控的溶酶体逃逸,具有优异的细胞免疫。由于Pickering乳液的柔性,CSPE乳液在细胞膜表面发生应力形变,模拟天然病原体的变形性,促进了细胞对疫苗的高效摄取及细胞活化。在溶酶体的酸性条件下,CSPE乳液界面的壳聚糖颗粒向壳聚糖分子链转变,壳聚糖分子上的氨基质子化,利用乳液界面对颗粒的空间限域效应,实现了 CSPE乳液向分子链稳定的乳液转变,同时也实现了 CSPE乳液的质子累积效应。通过调节乳液上质子数目,实现了对溶酶体逃逸效率的调控。最终在高效的溶酶体逃逸和分子链稳定的乳液作用下,显著提高了抗原在细胞质内的交叉递呈。CSPE乳液能够显著促进细胞免疫应答尤其是CTL免疫应答,诱导Th1型免疫偏向,在EG7-OVA和B16-MUC1的预防性及治疗性肿瘤模型中均能显著抑制肿瘤的生长和延长小鼠生存期。4.研究颗粒分布在乳液外-界面-内部对颗粒-乳液复合佐剂免疫机制及佐剂效应的影响。构建了由壳聚糖颗粒和角鲨烯乳液组成的颗粒-乳液复合佐剂,颗粒分别分布在乳液外部、乳液界面以及乳液内部。结果表明,颗粒分布在乳液内部和界面产生的抗原储库效应明显,APCs募集能力强,淋巴结协同递送能力强;注射部位的组织中,颗粒分布在乳液内部和界面分别分泌更多的Th2和Th1型细胞因子。结果表明,颗粒分布在乳液界面具有最佳的Th1型免疫偏向,颗粒分布在乳液内部具有最佳的Th2型免疫偏向,颗粒分布在乳液外部诱导的体液及细胞免疫效果均不及前两者。