Nexilin表达对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞生长的影响及机制研究

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目的:通过建立1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞构建的帕金森病(PD)模型,观察下调Nexilin表达对SH-SY5Y细胞的生长以及相关通路的影响,探讨Nexilin下调对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用。  方法:  1.Nexilin shRNA转染SH-SY5Y细胞,Western blot检测转染24h、48h后Nexilin的表达,免疫荧光法检测Nexilin shRNA转染SH-SY5Y细胞48h后Nexilin的表达。  2.不同浓度MPP+对SH-SY5Y细胞生长的影响:SH-SY5Y细胞用不同浓度的MPP+(0、100、200、300、400、500、750、1000μM)处理24h,细胞活性使用MTT实验检测。  3.Nexilin下调对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞生长的影响,将实验分4组:①空白对照组(Blank);②MPP+处理SH-SY5Y细胞组;③shRNA-Nexilin转染细胞组;④shRNA-Nexilin转染到MPP+处理组;MTT实验检测SH-SY5Y细胞生长的变化;Western blot检测SH-SY5Y细胞p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT(ser473)与AKT的表达。  结果:  1.shRNA-Nexilin转染SH-SY5Y细胞后Nexilin蛋白表达结果:shRNA-Nexilin分别转染24h和48h,与空白对照组和shRNA-NC组比较:①24h抑制率为53.49%,P<0.001;②48 h抑制率为81.40%,P<0.001。  2.免疫荧光法检测SH-SY5Y细胞Nexilin的含量:转染shRNA-Nexilin后,与未转染的空白对照组及shRNA-NC组比较,胞浆中Nexilin蛋白表达明显减少。  3.不同浓度MPP+对SH-SY5Y细胞生长的影响:增加MPP+浓度,MPP+的神经毒性以剂量依赖的方式降低细胞的活性。MPP+浓度500μM处理24h后,细胞生长抑制率达到34.7%。  4.Nexilin下调对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞生长的影响:①Nexilin shRNA转染SH-SY5Y细胞,与未转染的空白对照组比较,细胞抑制率为22.6%。  ②shRNA-Nexilin转染后MPP+处理的细胞,使细胞抑制率达到55.9%,与仅采用MPP+处理组(抑制率34.6%)比较,细胞抑制率明显增加(P<0.001)。  5.MPP+处理SH-SY5Y细胞后,检测SH-SY5Y细胞中信号通路,结果p-ERK1/2、p-AKT(ser473)表达增加(P<0.001,P<0.01); Nexilin shRNA与空白对照组比较,p-ERK1/2和p-AKT(ser473)水平下降(P<0.01,P<0.001);Nexilin-shRNA转染到MPP+处理组与仅MPP+处理组比较,Nexilin下调后p-ERK1/2和p-AKT(ser473)水平下降(P<0.001,P<0.O1)。  结论:  1.Nexilin shRNA抑制了Nexilin在SH-SY5Y细胞中表达。  2.不同浓度的MPP+作用于SH-SY5Y细胞,细胞活性以剂量依赖的方式下降。  3.下调Nexilin表达加重了MPP+诱导SH-SY5Y细胞的损伤。  4.Nexilin通过影响p-AKT(ser473),p-ERK磷酸化水平参与MPP+对SH-SY5Y细胞的毒性作用。
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