[背景]　　 亚健康状态(sub-health status)是介于健康与疾病之间的一种中间状态，常表现为活力下降，反应能力降低，适应能力减退，但无明确的疾病诊断。流行病学调研显示:亚健康疲劳（fatigue of sub-health，FSH）是亚健康状态最为突出的临床表现型，当前在我国约有40％的成年人处于亚健康疲劳状态，已严重危害了人们的身心健康和工作生活。可见亚健康疲劳已经成为严重的公共卫生问题。然而，目前对于FSH的发生机制了解不多，临床上尚没有针对它的上市治疗药物。　　 动物模型具有可控性好、结果易获得、容易复制等优点，是现代生物医学研究中的一个极为重要的实验方法和手段，是阐明疾病的发生机制和药物研发的关键技术平台。近年来，本课题组对于亚健康疲劳动物模型进行了探索研究，先后建立了亚健康疲劳大鼠模型和小鼠模型，但随着研究的不断深入，发现这些模型存在着一定的问题。因此，本研究拟在前期研究基础上，改良造模的方法，进一步完善亚健康疲劳小鼠模型，为亚健康疲劳的机制研究及防治药物研发提供平台。　　 基因(gene)是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，通过编码功能蛋白质来体现基因组的功能。越来越多的证据表明基因表达的改变决定着人类疾病的发生发展过程。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约18-25个核苷酸的内源性非编码RNA，是真核细胞内基因表达调节的重要途径。miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因（mRNA），以降解靶基因或者阻遏靶基因的翻译。研究表明，miRNA参与细胞生长、分化和凋亡、发育调节、病毒防御、物质代谢等多种重要的生命过程，同时亦与肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病及神经系统疾病等多种疾病密切相关。因此，很有必要从基因表达调节方面探讨亚健康疲劳的发生机制。　　 中医药对于疲劳防治研究积累了丰富的经验。我们应用中医药理论结合大量的临床实践，研制出防治亚健康疲劳的中药复方——维康颗粒。前期研究表明:维康颗粒防治亚健康疲劳具有显著疗效，但其确切药理机制尚未阐明。因此，本研究拟首先在前期基础上进一步研制和完善亚健康疲劳小鼠模型;其次，观察维康颗粒对亚健康疲劳模型小鼠的干预作用;再次，应用基因表达谱芯片探讨维康颗粒对亚健康疲劳小鼠骨骼肌基因表达的调节作用;最后，应用miRNA表达谱芯片观察维康颗粒对亚健康疲劳小鼠骨骼肌miRNA表达的影响，并结合上述差异表达基因进行联合分析，以探讨维康颗粒干预亚健康疲劳的基因表达调控机制。　　 [目的]　　 首先，本研究在前期研究基础上进一步改良和优化造模方法，研制亚健康疲劳小鼠模型;其次，应用基因芯片技术，明确亚健康疲劳发生的骨骼肌基因表达异常机制;最后，阐明维康颗粒干预亚健康疲劳的基因表达调控机制，为其临床应用提供科学依据。　　 [方法]　　 1、亚健康疲劳小鼠模型的研制　　 实验一:亚健康疲劳小鼠模型的造模时间窗研究　　 造模方法的改良:　　 在本课题组前期建立的方法基础上进行改良。具体方法:采用9W-10W龄大的成年雄性KM小鼠;每日15:00，将小鼠强迫放入水深为0.8cm、大小为29cm×18cm×15cm的塑料盒内，1只/盒，于第二天9:00(共18h)将造模小鼠从水盒中拿出，然后正常饲养，18h/d，连续造模21d。　　 实验设计、实验分组、观察指标:　　 ①动态观察造模小鼠疲劳变化情况的实验中，将20只实验小鼠随机分为2组，模型组和对照组。模型组采用上述方法造模，而正常组不给予任何刺激，按常规饲养方法饲养。实验时间为21d。动态观察实验小鼠的疲劳情况的变化:采用负7％体重强迫力竭游泳1次/W，记录游泳时间。　　 ②动态观察造模小鼠的血生化、血常规以及器官组织病理学变化情况的实验中，将40只实验小鼠随机分为4组，即造模7d组、造模14d组、造模21d组以及正常对照组。实验各组处理方法同上。上述4组实验小鼠主要用于测试血生化、血常规及病理学检查等。　　 通过上述实验结果初步确定亚健康疲劳小鼠模型的造模时间窗。　　 实验二:亚健康疲劳小鼠模型的疲劳持续时间和精神行为学评价　　 实验分组、处理方法、观察指标:　　 随机分为2组:模型组和对照组。每组20只，其中10只用于行为学测试，包括旷场实验、悬尾实验、糖水偏好实验等，另外10只观察疲劳持续时间。　　 模型组:造模方法同上，连续造模7d。正常组:正常饲养。　　 2、维康颗粒对亚健康疲劳的干预作用　　 实验分组、处理方法、观察指标:　　 实验分为3组:正常对照组、模型对照组和维康干预组。　　 模型对照组:连续造模7d。造模的同时每天给予纯净水灌胃，20ml/kg，1次/d，共7d;维康干预组:连续造模7d。造模的同时每天给予剂量为6g/kg的维康颗粒，20ml/kg，1次/d，共7d;正常对照组:正常饲养，每天给予纯净水灌胃，20ml/kg，1次/d，共7d。　　 每组20只小鼠。其中10只用于测试疲劳程度，另外10只用于骨骼肌超微结构观察以及后续的miRNA、mRNA表达谱等分子机制研究。　　 3、维康颗粒对亚健康疲劳小鼠骨骼肌基因表达的调节作用　　 实验分组、处理方法:　　 实验分为3组:正常对照组、模型对照组和维康干预组。处理方法同2.。　　 基因表达谱芯片测试:　　 采用罗氏NimbleGen mRNA表达谱芯片检测实验各组小鼠骨骼肌基因表达谱的变化。　　 生物信息学分析:　　 利用生物学公共数据库GeneBank、博奥生物有限公司开发的MoleculeAnnotation System(MAS)3.0系统等，进行差异表达基因的生物学功能及生物信息学分析。　　 4、维康颗粒对亚健康疲劳小鼠骨骼肌miRNA表达谱的影响　　 实验分组、处理方法:　　 实验分为3组:正常对照组、模型对照组和维康干预组。处理方法同2.。　　 miRNA表达谱芯片测试:　　 采用Agilent miRNA表达谱芯片检测实验各组小鼠骨骼肌miRNA表达谱的变化。　　 生物信息学分析:　　 利用互联网上miRNA数据库及相关软件进行生物信息学分析，以获得差异表达的miRNA序列、调控的靶基因（包括验证的靶基因、预测的靶基因）以及调控的信号传导通路等，并进行miRNA和基因差异表达的相关性分析。　　 [结果]　　 1、亚健康疲劳小鼠模型的研制　　 筛选亚健康疲劳小鼠模型的造模时间窗　　 随着造模时间的延长，模型组小鼠的疲劳程度显著增加，与正常组小鼠比较有统计学意义(F=86.433，P＜0.01);在造模14d、21d时模型组小鼠血生化指标中BUN、ALT、AST、CK、TG、CHOL等水平显著增多，与正常组比较有统计学意义（F=19.262，P＜0.01），而在7d时模型小鼠上述指标没有显著差异(F=0.543，P＞0.05);组织病理学检查显示:在造模14d、21d时模型组小鼠肝脏、心脏出现了病理性损伤，而在造模7d时未见显著异常;在造模期间，实验各组小鼠血常规指标未见明显异常，无统计学意义（F=1.460，P＞0.05）。外观行为观察:造模7d时，模型组小鼠出现精神不振，易激惹，体重减轻，逃避反应降低等;造模14d时，小鼠精神倦怠，活动明显减少，消瘦明显，缩肩拱背等;造模21d时，少部分模型小鼠出现了死亡，其中用于疲劳测试的10只模型小鼠死亡3只，用于生化和病理检测的10只模型小鼠死亡2只，死亡率分别为30％和20％。　　 本实验表明:随着小鼠造模时间的延长，疲劳程度逐渐增加，同时从健康状态逐渐向亚健康、疾病、死亡转化的动态变化过程;而造模7d时小鼠可能处于亚健康疲劳状态。　　 亚健康疲劳小鼠模型的疲劳持续时间和行为学评价　　 将小鼠单独放入深度0.8cm的水中强迫站立，18h/d，连续7d，造成亚健康疲劳小鼠模型，进行疲劳持续时间和行为学评价。旷场实验中模型小鼠活动能力及心理焦虑情况与正常组比较未见显著差异，悬尾实验和糖水消耗实验均显示模型小鼠未见明显抑郁表现。疲劳恢复实验表明，模型小鼠的疲劳持续时间至少14d以上。总之，我们认为该亚健康疲劳小鼠模型能够较理想地模拟人类亚健康疲劳的临床表现及其特点。　　 2、维康颗粒对亚健康疲劳的干预作用　　 疲劳情况测定:与正常组比较，模型组和维康组小鼠的力竭游泳时间均显著下降，有统计学意义（F=25.225，P＜0.05）;而与模型组比较，维康组小鼠的力竭游泳时间显著升高，有统计学意义(F=25.225，P＜0.01)。　　 透射电镜结果表明:模型组小鼠骨骼肌细胞内线粒体损伤明显，可见多个自噬体，尤其是线粒体自噬，糖原颗粒较少。与模型组比较，维康组小鼠骨骼肌细胞内自噬体显著减少，线粒体损伤显著减轻，糖原颗粒显著增多。　　 3、维康颗粒对亚健康疲劳小鼠骨骼肌基因表达的调节作用　　 与正常组比较，模型组小鼠腓肠肌全基因组表达谱有显著不同，差异表达的基因有1240条，其中上调的有784条，下调的有456条。提示亚健康疲劳骨骼肌存在显著的基因表达异常，可能是其重要的机制之一。　　 为了考察维康颗粒对亚健康疲劳小鼠基因表达的调节作用。将模型组、正常组、维康组三组进行比较分析，发现维康颗粒可以把模型组差异表达的873个基因逆转。说明维康颗粒可以将模型小鼠70.40％(873/1240)的差异表达基因基本恢复正常。　　 对上述873个基因进行生物学功能分析结果表明:涉及到细胞间隙、细胞外区、细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网等多个细胞组分;蛋白结合、核酸结合、离子结合、ATP结合、抗原结合活性、转录因子活性、氧化还原酶活性、电子载体活性、肌动蛋白活性、生长因子活性等多个分子功能;免疫应答、细胞粘附、RNA转录、炎症反应、体液免疫反应、脂质转运、胆固醇和脂蛋白代谢、糖异生、氨基酸代谢等多个生物学过程。　　 信号通路分析表明:上述基因涉及到轴突导向、细胞骨架调节、细胞凋亡、糖酵解/糖异生、三羧酸循环、细胞因子及其受体相互作用、B细胞和T细胞受体通路、抗原加工和递呈、磷酸肌醇通路、Toll-like受体通路、PPAR通路、MAPK通路、Jak-STAT通路、NF-kB通路、胰岛素信号通路、钙信号通路以及多种氨基酸代谢通路等多条信号传导通路。　　 4、维康颗粒对亚健康疲劳小鼠骨骼肌miRNA表达谱的影响　　 miRNA表达谱芯片结果表明:与正常组比较，模型组小鼠腓肠肌组织差异表达2倍以上的miRNA有39个，其中有16个上调，23个下调。　　 为了考察维康颗粒对亚健康疲劳小鼠腓肠肌组织miRNA的调节作用。将模型组、正常组、维康组三组进行比较分析，发现维康颗粒可以把模型组差异表达的27个miRNA逆转。说明维康颗粒可以将模型小鼠69.23％(27/39)的差异表达miRNA基本恢复正常。　　 对上述26个miRNA的靶基因及其调控的信号传导通路预测分析，结果表明:可能涉及到细胞凋亡、细胞骨架调节、MAPK通路、mTOR通路、钙信号通路、磷酸肌醇通路、胰岛素通路、轴突导向、免疫相关的趋化因子通路、B细胞和T细胞受体通路、多种氨基酸代谢通路等多条信号传导通路。　　 差异表达的miRNA和基因的相关性分析:首先，两者涉及到的信号传导通路进行比较分析，结果表明有多条细胞内重要的信号传导通路重叠。提示上述miRNA可能参与有关基因表达的调控。其次，应用DIANA mirExTra软件，尝试将上述表达差异的miRNA和基因进行预测性相关性分析，结果表明:得分前5位有miR-122-5p、miR-218-5p、miR-702、miR-337-3p、miR-483-3p等。提示这些miRNA可能与亚健康疲劳基因表达的异常密切相关。　　 [结论]　　 1、本研究在前期研究基础上，进一步改良造模方法，最终确定亚健康疲劳小鼠模型的造模方法，即采用强迫成年雄性小鼠水中站立18h/d、连续7d。该动物模型简便、稳定、重复性好，可望为亚健康疲劳的机制研究及相关药物研发提供平台。　　 2、本研究首次明确骨骼肌细胞线粒体损伤及自噬，同时有大量的基因表达异常，有关的miRNA可能参与基因表达异常的调节，引起细胞内复杂信号传导网络的调控机制紊乱，从而导致亚健康疲劳的发生。　　 3、本研究首次明确中药复方维康颗粒能够通过修复细胞结构损伤，调节有关基因的表达水平，以发挥防治亚健康疲劳的作用。