论文部分内容阅读
X染色体是研究表观遗传修饰的模式材料，X异常失活对动物克隆效率是否造成影响，至今仍有争议。本文以来源不同供体核成活克隆牛X染色体作为研究对象，以期发现X表观修饰异常与动物克隆效率有无相关性。
利用亚硫酸氢盐测序法，对胎儿成纤维细胞(FFB)和输卵管上皮细胞(FOV)来源的克隆囊胚及克隆牛Xist基因DNA甲基化进行研究，结果发现，克隆囊胚Xist基因处于较低的DNA甲基化水平，其中FOV来源的克隆囊胚甲基化程度仅为17％；体外受精囊胚DNA甲基化程度为49％。所检测的克隆囊胚Xist基因甲基化程度普遍降低，这说明Xist基因DNA甲基化是可以被重编程的，但在不同供体核之间的重编程也有一定差异，该结果也说明本实验检测的CpG岛可能在调节Xist基因的表达中起作用。胎儿成纤维细胞来源的克隆牛Xist基因DNA甲基化程度相差不大，分别为57％、58％、64％和67％，与自然繁殖牛的耳组织样比较(87％)，其DNA甲基化程度均有所降低；相反，以输卵管上皮细胞为供体核的克隆牛，Xist基因DNA甲基化程度相差很大，甲基化程度高的克隆牛达到90％，而1262克隆牛甲基化程度仅为15％，甚至比胚胎期的甲基化程度还低。由于Xist基因是负责调节X失活起始最重要的基因，可能影响到X的失活。克隆牛1262Xist基因的DNA甲基化程度很低，却能正常生长和发育，这说明存活的克隆牛Xist基因DNA甲基化可以是异常的。
利用免疫荧光单染实验，检测不同供体核克隆牛X中期染色体组蛋白修饰的状况。结果发现，早期发育的重编程能够比较完全地消除H3K4m2修饰，克隆牛耳组织能够表现出自然繁殖牛耳组织细胞的H3K4m2标记；H3K9m2修饰比较均匀地散布在整条X染色体上，不同供体核克隆牛仍然带有H3K9m2修饰的细胞记忆；H3K27m3修饰与同源异型基因沉默相关，该修饰在克隆牛中既没表现出自然繁殖牛耳组织的修饰状态，又与供体核细胞的修饰有差异，特别是输卵管上皮细胞来源的克隆牛差异更大，这说明由于受到其细胞原始标记的影响，重编程过程不能很好的消除和添加H3K27m3修饰。上述结果也暗示，即使X染色体表观修饰异常，克隆牛也能安全存活。
免疫荧光双染的实验结果，发现多种组蛋白修饰富集在一起，即在Xp22和Xq23-33附近是耳组织组蛋白修饰集中区域，富集K4m2、K4m3修饰的同时也富集K27m3，同样，K9m2修饰少的X染色体，其它组蛋白修饰如K4m2、K4m3及K27m3也少。免疫荧光染色能够显示整条X染色体组蛋白修饰的分布及强度，但其分辨率很低，不能高分辨地显示基因某一区段的修饰状况，组蛋白修饰的富集只能说明该区段的基因处于活跃的表达调节状态。目前发现去甲基化酶是能够催化一和二甲基化的H3K4去甲基化，这也间接支持重编程能够比较完全地消除H3K4m2修饰的结论。