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细胞凋亡是细胞的主动消亡过程,是生物体细胞维持机体平衡的关键,其过程极为复杂涉及一系列调控因子。中药多糖为中草药提取物的主要活性成分,因其具有毒副作用较小,耐药性低等优良特性而引起国内外学者的关注,中药多糖能够促进水产动物的生长,增强饵料利用率,提升先天性免疫反应,增加抗菌活性等。本试验通过研究黄芪多糖(Astragalus Polysacharin,APS)和当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide,ASP)对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,简称维氏菌)诱导的鲫(Carassius auratus)细胞凋亡的影响及对细胞凋亡途径和抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因BAX的表达调控影响,探究中药多糖对鲫细胞凋亡的影响效果和影响凋亡的作用机制,从而为中药多糖在水产病害防治等方面提供科学依据。1黄芪多糖和当归多糖对维氏气单胞菌诱导的鲫细胞凋亡的影响试验设阴性对照组、阳性对照组,黄芪多糖组和当归多糖组四个处理组,每个处理组设三个平行组,每个平行30尾鲫,通过对鲫用维氏菌攻毒处理,用流式细胞仪测定血细胞的凋亡比例和细胞周期变化,并用荧光显微镜和透射电镜观察凋亡细胞的形态。结果显示:维氏菌攻毒后阳性对照组鲫血细胞的细胞凋亡率均极显著高于多糖组和阴性对照组(P<0.01);多糖组能显著降低鲫的细胞凋亡且黄芪多糖组的效果更显著;攻毒后鲫肝细胞和肾脏淋巴细胞出现染色质凝集,细胞核固缩边集和细胞空泡化及凋亡小体;同阴性对照组相比维氏菌攻毒可以引起鲫血细胞周期中S/G2+M期细胞比例极显著下降,sub-G1极显著升高,抑制细胞分裂诱发凋亡;多糖组则G0/G1期细胞极显著降低,S/G2+M期细胞极显著升高,sub-G1极显著降低,促进细胞分裂抑制凋亡。黄芪多糖和当归多糖添加量在1%时能抑制维氏菌攻毒引起的细胞凋亡。2黄芪多糖和当归多糖对维氏气单胞菌诱导的鲫细胞凋亡通路的影响试验设阴性对照组、阳性对照组,黄芪多糖组和当归多糖组四个处理组,每个处理组设三个平行组,每个平行30尾鲫,维氏菌攻毒处理后用ELISA法测定鲫血细胞的细胞色素C(cyt-c)含量变化,用流式细胞仪测定血细胞的凋亡比例、线粒体膜电位、胞内pH、胞内游离钙离子浓度,并对血细胞caspase-9、caspase-3的酶活力进行测定。结果显示:在相同检测时间点阳性对照组血细胞凋亡率均极显著高于多糖组和阴性对照组(P<0.01),且攻毒后24h鲫血细胞凋亡率最高为21.40%,此时出现细胞核染色质凝集和边缘化形成特异性的“新月形”边集及凋亡小体的凋亡细胞和明显的不均等有丝分裂;攻毒能够显著诱导鲫血细胞胞内酸化和胞内游离Ca2+浓度上升,进而造成线粒体膜电位显著降低和cyt-c含量caspase-9、caspase-3酶活力的依次显著升高(P<0.05),从而诱发鲫血细胞线粒体通路细胞凋亡。黄芪多糖和当归多糖添加量在1%时能够通过抑制线粒体细胞通路来降低维氏气单胞菌诱导的细胞凋亡。3黄芪多糖和当归多糖对鲫凋亡基因BAX和Bcl-2表达的影响通过同源克隆测序获得鲫凋亡基因BAX和Bcl-2部分mRNA序列,采用RT-PCR方法检测鲫BAX和Bcl-2基因在六种组织中的相对表达量。维氏菌攻毒处理后检测鲫血细胞的凋亡比例变化,观察凋亡血细胞的形态并测定BAX和Bcl-2基因在鲫血细胞中的表达变化。结果表明:通过序列比对发现鲫同鲤鱼的Bcl-2基因核苷酸序列相似性最高达96%,系统进化分析显示鲫和鲤形目的鱼类紧密聚在一支同鲤鱼的亲缘关系最近,较其他物种鲫和鲤形目以及鲈形目等进化地位较低的硬骨鱼类亲缘关系较近;BAX基因在鲫六种组织中的表达量从高到低分别为血液>肝脏>头肾>心脏>脾脏>肌肉,Bcl-2基因从高到低分别为血液>肝脏>头肾>心脏>肌肉>脾脏;攻毒后能够引起显著的细胞凋亡且24h凋亡率达到最高21.70%,此时能够引起鲫血细胞出现细胞皱缩,细胞核边集等显著的细胞凋亡形态变化;攻毒后Bcl-2和BAX基因相对表达量均表现出先升高后降低的趋势,Bcl-2/BAX在阳性对照组中出现显著降低,且在攻毒后24h和48h间出现最低点,在黄芪多糖组和当归多糖组均出现显著升高,分别在攻毒后24h和72h出现最高值。黄芪多糖和当归多糖在饲料中添加量为1%时可通过促进增大Bcl-2/BAX来有效抑制维氏菌诱导的细胞凋亡。