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鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestiffer,RA）是鸭、鹅等禽类传染性浆膜炎的病原,为G-球杆菌,至少存在21个血清型,且缺乏交叉免疫保护。在我国,传染性浆膜炎迄今仍然是危害鹅、鸭养殖业的主要常发病之一,造成巨大经济损失。该病灭活菌苗和活菌疫苗文献报道多,血清1型、血清1、2型二价油乳剂灭活苗已经在我国商品化生产。但是,这些疫苗的实际应用效果欠佳。分析认为,RA灭活油乳剂苗免疫诱导期为10～14天,这期间为免疫空白期,对于尚未建立起良好生物安全措施的养殖场,鸭、鹅在免疫空白期感染RA而发病,结果是免疫失败。本课题组研究证明,鸡抗RA蛋黄抗体（C-RA Ig Y）对鸭、鹅具有很好的被动免疫保护效果,可以弥补RA油乳剂灭活疫苗的免疫空白期。RA菌体热酚法抗原（RA-PEAg）采取琼脂免疫双向扩散试验（Agar gel immunodiffussion test,AGID）测定C-RA Ig Y制品抗体效价与易感鸭被动免疫攻毒测定的效力结果具有相关性。RA无菌滤液具有免疫保护效力。为了深入比较RA菌体与无菌滤液制备疫苗的免疫效力差异,本文开展了RA胞外多糖抗原及其产生规律研究,获得如下结果。1.RA菌体LPS抗原制备。比较超声波处理（Ultrasonic treatment,US）、高压裂解（High pressure cracked,HP）及苯酚提取法（Hot phenol extract,PE）制备的RA可溶性抗原,用鸡抗RA特异蛋黄抗体（RA-CIg Y,经鸭被动免疫保护试验证明其免疫保护效力）进行AGID检测。结果是,三种方法制备的RA抗原,即HPAg、USAg、PEAg的沉淀线相互融合,血清1、2型间沉淀线交叉。PEAg敏感性高,较US Ag和HP Ag高1-2个滴度。PEAg用10%三氯醋酸（Trichloroacetic acid,TCA）处理后的样品（PET Ag）,1型RA SC株两个批次蛋白含量从处理前的106.38μg/m L、126.38μg/m L下降到41.86μg/m L和60.19μg/m L,蛋白去除率为60.65%和52.37%;2型AF株PE Ag蛋白含量从95.43μg/m L、47.10μg/m L下降到30.43μg/m L、和6.38μg/m L,蛋白去除率为68.13%和86.45%。AGID检测结果,PET Ag沉淀线较居中且清晰,抗体高稀释度孔沉淀线特别靠近外周抗体孔,导致其敏感性下降略0.5个滴度。PE Ag采取氯仿处理（Sevag法,氯仿:正丁醇,PES Ag）,1型SC株两批抗原蛋白含量为70.90μg/m L、50.19μg/m L;蛋白去除率为33.36%和60.29%,2型AF株两个批次蛋白含量为26.14μg/m L、1.38μg/m L,蛋白去除率为72.61%和97.07%。AGID检测时,处理前后沉淀线模式未有变化,但PES Ag敏感性增加略0.5个滴度。冷藏保存30天后,PET Ag未受影响,而PES Ag在保存14天时,2型AF株的3批样品有2批失效。PE Ag及去蛋白处理后的PET Ag和PES Ag,鲎试剂（0.25EU/m L）定性检测为阳性。结果显示,PE Ag为菌体LPS Ag,特异性、稳定性好。2.RA-PET Ag浓度AGID及间接ELISA检测方法的建立。AGID效价为0、2及5log2的RA-CIg Y样品各3份作为参考抗体,建立AGID和间接ELISA检测RA-PET Ag浓度的方法。AGID结果是,RA-CIg Y样品（AGID效价为5log2）4x稀释后加样于中央孔,RA-PET Ag或培养物无菌滤液（Filtrated solution,FS）样品连续2x稀释加于外周孔,AGID出现沉淀线的最高稀释度判为RA-PET Ag或胞外多糖抗原（Extracellular polyscharride,EPS）浓度。PET Ag浓度为1:64的样品用于间接ELISA抗原,RASC-PETAg和RAAF-PETAg分别稀释10或50倍后包被酶标板,用HRP-羊抗鸡Ig Y建立检测RA-CIg Y样品抗体效价的间接ELISA。阴性30份样品200倍稀释,A450值平均值为0.128和0.126。从中任选3份样品为阴性参考抗体（Cn）。以2.1x Cn A450为临界值。用鸡抗AIV A型H9亚型Ig Y样品和鸡抗鸭肝炎病毒蛋黄抗体样品进行特异性试验,结果两份样品1:400稀释度均为阴性结果。RA1、2型CIg Y样品体效价达到1:25600和1:6400,异血清型之间交叉检测为阴性结果。结果显示,间接ELISA检测RA LPS抗原具有高度敏感性和特异性。3.RA胞外抗原物质提取。RA的TSB 16h培养物,两次离心弃沉淀（菌体）,上清液通过0.22μm除菌过滤即制成FS样品。然后采取十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium Bromide,CTAB）粗提获得样品（FSE）。结果是,CTAB浓度为0.1%～0.8%和4℃～8℃环境下制备的FSE,AGID检测时与RA-CIg Y反应出现沉淀线,且与RA-PE Ag的沉淀线形成融合。CTAB浓度为0.2%组浓度最高。RA 1型SC株FSE样品（AGID测得浓度为1:4）,静脉和肌内注射7和14日龄小鸭。48h内,实验鸭体温变化幅度小于0.5℃,精神、行走、吃料、粪等未有异常。结果显示,RA培养物无菌滤液中存在与菌体LPS抗原相同反应原性的多糖抗原,即胞外多糖抗原。4.RA-EPS Ag产生规律。RA分别用TSB和LB培养制备FS样品,稀释后与参考RA-CIg Y抗体1:200稀释液等量混合,置37℃反应1h后,离心取上清液用于间接ELISA检测。以RA-PET Ag为参考RA-CIg Y的1:400稀释为对照,计算阻断管样品A450减少值,由此计算阻断率。结果是,1型SC株,TSB组阻断率为58.80%,LB组为44.64%,两组间存在极显著差异（P值<0.01）;2型AF株,TSB组阻断率为51.72%,LB组为43.4%,两组间存在显著差异（P值<0.05）。1型SC株为试验对象,兔、鸭、鹅血制成的巧克力TSP培养菌悬液无菌滤液样品阻断率分别为75.59%、69.05%、68.52%,前者与后两者间显著差异（P<0.05）。病死鸭回收的SC株FS样品,TSB传第3代培养12h的阻断率为21.07%,之后增加,72h达到峰值,但24～96h阻断率为32.08%～39.30%,变化幅度不大。第4、5代组培养时间为12h时的阻断率仅为7.97和3.81%,24h达到31.24%和25.38%,96h达峰值。结果显示,RA在TSB中EPS产量高,兔血更有利于其产生,体外传代会影响其产生量。5.鸭体内EPS产生规律。RA1型SC株人工感染14日龄鸭,血浆FS用AGID检测。结果是,12h全部（3/3）为阳性,浓度为1:2,24h后迅速升高至1:8,36h则达到1:16。鸭体血液内RA EPS浓度与血液载菌量动态变化一致。2型AF株组12h和24h均为阴性,36pih浓度为1:2,48pih上升至1:8。该组血液载菌量动态变化与1型SC株一致,但感染早期EPS Ag呈阴性结果,显示出两株菌EPS产生存在差异。