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目的:通过研究蛋白质相互作用的方法,验证MyD88与Siahl相互作用的真实性,并对其相互作用的意义做初步的探讨。
方法:本实验室首先通过酵母双杂交技术初步筛选到了472对相互作用对。然后采用无酶克隆技术大规模构建了荧光共定位载体。共转染哺乳动物细胞Hela(或293T),筛选到了一系列相互作用对。由于MyD88是TLR信号通路中的重要接头分子,与很多疾病相关,关于他的研究意义很大,同时Siahl的生化性质比较明确,所以我们挑选了MyD88与Siahl做进一步的研究。做了免疫共沉淀,免疫荧光共定位,双荧光报告基因检测等实验。
结果:在外转质粒的情况下,免疫荧光共定位实验结果为阳性,并鉴定了MyD88与Siahl互作的结构域是DBD域。在293T细胞中,外转质粒时,免疫共沉淀的结果也为阳性。双荧光报告基因检测初步显示Siahl对TLR信号通路的影响为负调控。这一结果可能发现了TLR信号通路负调控的新机制。