【摘 要】
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目的:静脉注射用腺病毒载体转染人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因的脂肪干细胞(ADSCs)于兔骨质疏松性骨折(OPF)模型体内,观察其对骨折愈合的修复作用。方法:1在新西兰大白兔颈项部提取适量脂肪组织,分离传代培养ADSCs至第3代。用腺病毒载体将hBMP-2基因转染至转染ADSCs组干细胞内,荧光显微镜下观察转染效率。10 d后逆转录酶聚合酶链反应法(RT-PCR)检测hBMP-2mRNA的
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目的:静脉注射用腺病毒载体转染人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因的脂肪干细胞(ADSCs)于兔骨质疏松性骨折(OPF)模型体内,观察其对骨折愈合的修复作用。方法:1在新西兰大白兔颈项部提取适量脂肪组织,分离传代培养ADSCs至第3代。用腺病毒载体将hBMP-2基因转染至转染ADSCs组干细胞内,荧光显微镜下观察转染效率。10 d后逆转录酶聚合酶链反应法(RT-PCR)检测hBMP-2mRNA的表达水平,采用蛋白印迹杂交法(WB)检测hBMP-2蛋白的表达情况。2 48只新西兰大白兔采用双侧卵巢去势法,联合右侧股骨中下段2 mm骨缺损骨折法制备兔OPF模型。造模后随机分组法分为3组:转染干细胞组(16只,简称转染组)、未转染干细胞组(16只,简称空载组)、对照组(16只);造模术后第3天开始静脉移植干细胞,每天1次,共3天。各组在移植后4周和8周时间点进行免疫组织化学法(IHC-P)检测血清骨生化4项;用X线摄片半定量评分法比较各组兔子骨质大体形态修复程度;HE染色方法了解各组兔子骨组织的病理变化;转染组行共聚焦显微镜示踪检测荧光标记蛋白表达情况,评估干细胞移植归巢效果。结果:1分离、转染细胞从兔颈项部脂肪组织成功分离出ADSCs,用腺病毒载体将hBMP-2基因转染于ADSCs,转染后培养72 h时,细胞荧光效果增强;10 d后,转染率达87%。RT-PCR检测转染ADSCs组内hBMP-2mRNA相对表达较ADSCs组及空白组显著增高(P<0.01);WB检测发现转染ADSCs组hBMP-2蛋白表达显著高于ADSCs组及空白组(P<0.05)。2去势后兔腰椎骨密度(BMD)检测在去势24周时骨密度丢失较去势前超过25%(P<0.05),差异具有统计学意义。3血清ELISA检测骨生化4项转染组、空载组抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、骨碱性磷酸酶(BAP)、骨钙素N端中分子片段(N-MID OC)蛋白在第8周时实验组较对照组均有下降(P<0.05),转染组较空载组下降明显(P<0.05),差异有统计学意义。转染组、空载组25-羟基维生素D(25-(OH)-VD)蛋白在第4周及第8周较对照组均上升(P<0.05),转染组较空载组在第4周时升高,差异无统计学意义(P>0.05),转染组在第8周时较空载组有显著升高(P<0.05)。4 X线摄片半定量评分4周时转染组大白兔右侧股骨干骨折端有大量骨痂形成;空载组骨折处可见外骨痂生长;对照组骨折端可见清晰骨折线。8周时转染组骨折线消失;空载组有较多外骨痂形成;对照组出现大量外骨痂,仍可见部分骨折线迹象。X线半定量评分:4周时转染组与空载组评分较对照组有升高(P<0.05),转染组评分较空载组有显著升高(P<0.05)。8周时,转染组评分显著高于空载组(P<0.05),转染组及空载组高于对照组(P<0.05)。5 HE染色4周时转染组可见较多破骨细胞;空载组骨小梁生长稀疏,破骨细胞少,对照组见少许骨小梁生长,见极少破骨细胞。8周时转染组骨小梁排列有序,形成哈夫斯管;空载组见少量哈夫斯管形成,密度不均;对照组骨小梁排列错乱,见较多破骨细胞生长。6激光共聚焦显微镜示踪检测在转染组大白兔干细胞移植4周时可见兔骨折处有绿色免疫荧光蛋白表达,而在同只实验兔对侧(左侧/健侧)股骨相同部位仅有极少量荧光蛋白表达。移植8周后可见右侧股骨骨折处仍有免疫荧光,健侧骨组织未见荧光蛋白表达。结论:静脉注射hBMP-2基因转染的ADSCs可有利于促进兔OPF愈合修复。
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