中国作为世界柑橘的重要生产国之一,栽培历史悠久,品种资源丰富。柑桔的无核育种目前仍然以常规育种为主,基于杂交的传统育种手段耗时长且难以满足定向改良的需求,芽变、实生选种及诱变育种的成功率较低,产生的突变有一定的随机性。近年来基因工程育种作为一种重要辅助手段在柑橘遗传改良中得到应用,基因工程育种可以根据人们的意愿定向改造生物目标遗传特性,创造出新的种质资源,但是转基因技术引发了很多争议,因有外源基因的插入问题,目前转基因技术安全性受到公众的广泛重视。CRISPR/Cas9技术作为一门新兴的第三代基因编辑技术,可以实现在基因组水平上对目标基因定点修饰,并且有研究表明其产生的突变可以遗传给下一代,近些年来CRISPR/Cas9技术逐渐成为研究基因功能的一种新方法。microRNAs(miRNAs)是一类长度约为19-26 nt的内源性非编码单链RNA分子,广泛存在于动植物细胞中,植物microRNA主要通过直接剪切或抑制翻译的方式对靶基因mRNA发挥转录后调控作用。先前的研究表明,一些miRNAs在不同物种之间都具有序列和功能上的保守性,它们主要参与调控植物器官的形态建成和生长发育、植物逆境胁迫反应、植物激素调节和信号转导以及其他重要的生物过程。植物miR167是一类保守的miRNA,它的靶基因有转录因子ARF6和ARF8,主要参与调控植物花和果实发育相关的过程。本研究初步探索了利用CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术对柑橘和番茄miR167a前体序列进行编辑,以期运用该技术开展柑橘无核种质的创制,并对miR167a的功能进行研究。本研究主要取得的研究结果如下:1、利用miRBase数据库搜索并下载出番茄sly-miR167a以及柑橘csi-miR167a的成熟序列和前体序列,分别与NCBI中柑橘和番茄基因组数据库进行BLAST比对,找到它们相应的基因组DNA序列。通过对柑橘csi-miR167a和番茄sly-miR167a成熟序列比对分析,发现两者同源性很高,说明miR167a在柑橘和番茄中的成熟序列保守性较好。同时比对两者的前体序列后发现存在一定的差异,说明miR167a在柑橘和番茄中的前体序列保守性较差。2、针对柑橘csi-miR167a前体序列和番茄sly-miR167a前体序列,利用在线软件分别设计gRNA位点,分别是csi-gRNA和sly-gRNA,并且成功构建了重组pKSE401和pP1C.1C两种类型的CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化体系,进行柑橘上胚轴茎段和番茄子叶的遗传转化试验。在番茄的遗传转化中,经过抗性筛选和PCR检测,鉴定到67株转pKSE401载体的再生植株,经过PCR产物测序分析,与野生型植株的基因序列进行对比,靶标位点区域未发现碱基差异。对于转pP1C.1C载体的番茄材料,得到含荧光标记的愈伤组织,测序结果显示靶标位点区域仍然没有发生基因编辑。进一步通过gRNA靶点效率体外检测试验,发现gRNA靶标位点体外酶切效率不高,由此推测番茄的遗传转化材料中没有发生基因编辑情况,原因在于gRNA位点的设计有缺陷。3、改进试验后,我们使用在线软件和体外检测相结合的方式设计gRNA靶标位点,在线软件对番茄sly-miR167a前体的同源序列设计多个gRNA靶标位点,再通过体外切割效率检测,最终验证得到体外切割成功的gRNA——G1。构建pP1C.1C表达载体后,通过农杆菌介导法转化番茄,得到3个有荧光标记的突变体材料。测序分析结果表明,3个突变体材料在基因组靶标位点区域均出现不同类型的碱基突变,主要是碱基缺失和单碱基插入。本研究通过在线设计结合体外检测gRNA靶点切割效率的方法,在本实验室创建了高效的CRISPR/Cas9体系,并且使用该体系已成功引起特定基因的编辑,说明该方法是可行的。在以后的研究工作中,我们可以利用这个系统来编辑柑橘的miR167a前体序列,从而获得柑橘的突变材料并研究miR167a在柑橘中的功能。