论文部分内容阅读
目的:通过体外培养大鼠睾丸间质细胞,观察硫酸镍致大鼠睾丸间质细胞ROS水平与细胞凋亡的关系,以及内质网应激和线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平的变化,探讨ROS在镍诱导大鼠睾丸间质细胞内质网应激和线粒体凋亡通路中的作用。方法:(1)采用0.25%胶原酶消化大鼠睾丸组织分离出睾丸间质细胞,Percoll连续梯度分离液对其进行纯化,并采用贴壁培养法再次纯化。通过3β-HSD对纯化后的细胞进行纯度鉴定。(2)纯化后的大鼠睾丸间质细胞,给予不同浓度(0、250、500和1000μmol/L)NiSO4分别处理0、6、12和24h,通过MTT法和LDH渗漏法检测各组细胞存活率和培养液中LDH活力。(3)取对数生长期间质细胞,经自由基清除剂NAC和TEMPO提前干预1h后,再行500μmol/L NiSO4处理12h。采用DCFH-DA探针法观察大鼠睾丸间质细胞内ROS水平,DAPI荧光染色法观察细胞核形态学变化,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。采用Western blot法检测大鼠睾丸间质细胞内质网应激相关蛋白GRP78、GADD153和Caspase-12,以及线粒体凋亡通路相关蛋白Bak、Cyt C、Caspase-9和Caspase-3的表达水平。结果:(1)纯化的间质细胞贴壁生长24h后,通过3β-HSD染色法鉴定,可得到纯度较高的间质细胞。(2)与对照组比较,250、500和1000μmol/L NiSO4分别处理6、12和24h后,不同处理组细胞存活率均显著下降(P<0.05),细胞培养液中的LDH活力均显著升高(P<0.05),且随着NiSO4处理浓度和时间的增加,细胞存活率逐渐降低,细胞培养液中LDH活力也逐渐升高。(3)与对照组比较,500μmol/L NiSO4处理12h组(NiSO4组)荧光显微镜下可见间质细胞中ROS水平明显升高。与NiSO4组比较,经5mmol/L NAC(NAC组)和1mmol/L TEMPO(TEMPO组)干预后,间质细胞中ROS水平明显下降(P<0.05)。DAPI荧光染色后,镜下可见NiSO4组细胞体积变小,细胞核固缩或裂解,呈梭状和镰刀状,部分染色质呈现浓缩状态,可见凋亡小体;NAC组细胞核可见固缩,边缘呈梭状,不完整;TEMPO组细胞核大多为正常圆形,少见固缩和不完整边缘的细胞核,凋亡小体明显减少。流式细胞术定量检测细胞凋亡率发现,与对照组比较,NiSO4组间质细胞凋亡率显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与NiSO4组比较,NAC组和TEMPO组间质细胞凋亡数量均明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,NiSO4组间质细胞内质网应激相关蛋白GRP78、GADD153和Caspase-12以及线粒体凋亡通路相关蛋白Bak、Cyt C、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与NiSO4组比较,NAC组细胞上述蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义(P<0.05),而TEMPO组除Caspase-3以外,其他蛋白表达水平显著下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:NiSO4对大鼠睾丸间质细胞的损伤可能与其诱导间质细胞ROS大量生成和凋亡率增加有关。NiSO4可通过上调内质网应激和线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平,但前述变化均可被自由基清除剂NAC和TEMPO所阻抑,表明ROS可能在硫酸镍诱导的大鼠睾丸间质细胞内质网应激和线粒体凋亡通路中发挥重要作用。