目的：　　α(2,3)唾液酸多糖在神经系统中发挥着重要作用，参与调节诸如细胞迁移，轴突生长和收缩，突触的形成和稳定以及突触的功能等过程。其中3’–SLN存在于众多α(2,3)唾液酸多糖末端，是多糖发挥作用的关键位点，同时也可能成为神经系统疾病的治疗靶点，但由于3’–SLN在神经系统中的研究和报道较少，3’–SLN的提纯和合成成本高昂，不利于进一步的研究和应用，因此，本课题旨在应用朝鲜槐凝集素 MAA对3’–SLN糖的特异识别作用和噬菌体多肽展示技术筛选出3’–SLN的糖模拟肽，在结构和功能上替代3’–SLN，以利于进一步研究3’–SLN的功能和新的治疗药物及靶点。　　方法：　　1.噬菌体展示肽库淘选　　根据肽库说明书，进行四轮淘选，第一轮主要过程：　　(1)靶分子包被：100μg/ml朝鲜槐凝集素MAA溶于pH8.6的NaHCO3溶液，包被于96孔板中，4℃过夜。　　(2)噬菌体结合及洗脱：倒掉包被液并将板孔拍甩干净，加满封阻液，4℃作用2 h。0.1％TBST缓冲液洗6次，去除封阻液，加入100μl，0.1%TBST缓冲液稀释的4×1010噬菌体（即10μl原始文库），室温孵育60 min，去除孵育液，0.1%TBST缓冲液洗板10次。加入100μl TBS稀释的1 mM的3’–SL溶液，室温摇动60 min，洗脱液转入微量离心管，测定滴度。　　(3)噬菌体扩增：将ER2738单克隆菌过夜培养物1:100稀释于20 ml LB培养液中，加入上述洗脱物，37℃剧烈摇动培养4.5 h。培养物经离心，PEG/NaCl沉淀等过程，得到扩增后噬菌体，测定滴度。　　(4)按上述过程再包被板孔，进行第二、三、四轮扩增，噬菌体以洗脱物扩增后的滴度计算相当于1～2×1011 pfu的加入量，同时在清洗步骤中将TBST中Tween–20的浓度增至0.5%（v/v），第四轮淘选时的洗脱物不再扩增。　　2.噬菌斑测序　　对第四轮淘选后的洗脱物进行滴度测定，用吸头从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选一蓝色噬菌斑到1 ml培养管中，保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。每个单克隆分别进行扩增，得到单克隆噬菌体贮液。提取每个单克隆噬菌体DNA，送上海生工生物工程公司测序。　　3. ELISA检测结合噬菌体　　(1)将得到的单克隆噬菌体进行再扩增以扩大滴度。　　(2)针对每个单克隆，按淘选方法包被靶分子，未包被孔作为对照，所有孔经过封阻液封闭后，加入系列稀释的单克隆噬菌体，室温作用2 h。0.5%TBST缓冲液洗板6次，加入1:5000稀释的HRP标记的抗M13抗体，室温震荡作用60 min，0.5%TBST缓冲液洗板6次，加入ABTS底物溶液，室温作用10～60 min。用酶标仪记录410 nm处的吸光值。　　4.多肽合成　　根据测序结果及ELISA结果，选取含有重复序列的阳性克隆，将DNA序列翻译成蛋白序列，送上海翰鸿化工科技公司合成多肽，并命名：B30，B37，C13，C23， Random（随机选自肽库的阴性对照十二肽）。　　5. ELISA检测结合多肽　　(1)多肽包被：待检测多肽用PBS稀释至10～100μg/ml，37℃放置至少12 h。　　(2)封阻：去除包被液，加入无糖封闭液，室温放置60 min。　　(3)抗体结合及显色：去除封闭液，PBS洗3遍，加入生物素化MAL–I或MAL–II（另：竞争性实验，预先将 MAL–I或 MAL–II与3’–SLN，4℃下孵育过夜），室温孵育60 min，PBST洗3遍，加入抗生物素蛋白二抗，室温放置60 min，去除二抗，加入ABTS底物，测量410 nm处吸光度。　　6.神经细胞原代培养　　小脑颗粒神经元取出生后5～8天，海马神经元取新生当天的C57BL/6J小鼠，按操作录像分离小鼠小脑颗粒层组织或海马组织，分离的组织经Tripsin/DNase I消化后，依次用大中小三种口径的玻璃吸管各吹打10次，使其形成浑浊的细胞悬液，取上清离心后加DNase I重悬，细胞滤网过滤，再离心，去上清加入Neurobasal A完全培养液，计数。　　7.突起生长实验　　(1)先包被PDL于48孔板，4℃过夜，再包被CD24，37℃放置4 h，只包被PDL孔作为阴性对照。　　(2)每孔种植1×104个小脑或海马神经元，培养60 min后换新完全培养液并加入3’–SLN或模拟肽，继续培养24 h。　　(3)2.5%戊二醛水溶液固定，神经轴突染色液染色，去离子水清洗，晾干。　　(4)相差显微镜采集图像，应用Image–Pro Plus软件测量100个独立细胞的突起长度。　　结果：　　1.噬菌体肽库淘选滴度测定　　(1)噬菌体肽库淘选过程中，四轮洗脱后噬菌体滴度均大于1×103 pfu/μl，显示本肽库与靶分子MAA有较好的亲和力。　　(2)淘选过程中，三轮扩增后噬菌体滴度均大于1×109 pfu/μl，满足肽库说明书中的要求，显示较好的扩增效率。　　2.噬菌体插入DNA序列测序　　52个噬菌体单克隆进行DNA测序后，得到8个含有重复序列的单克隆噬菌体，分别为B49（重复4次），B37（重复2次），C13（重复2次），B30（重复3次），A15（重复8次），B36（重复3次），C23（重复3次），A14（重复3次）。　　3.噬菌体与MAA凝集素的亲和性鉴定　　8个含有重复序列的噬菌体单克隆中，与其余克隆相比，B37，C13，B30，C23四个克隆具有较好的结合强度和特异性。　　4. MAL–I和MAL–II对3’–SLN糖的识别　　MAL–I能识别3’–SLN而MAL–II不能识别3’–SLN。　　5.合成多肽与MAL–I和MAL–II的亲和性鉴定　　合成的B37，C13，B30，C23四个多肽中，只有B30肽与MAL–I和MAL–II都显示出较高的亲和性，其余三个多肽亲和性较低。　　6.竞争性ELISA检验B30模拟肽对3’–SLN结构的模拟功能　　3’–SLN的存在能够抑制B30与MAL–I的结合，抑制效果达到48.93%，而B30与MAL–II的结合不受抑制，表明B30和3’–SLN结合于MAL–I的相同部位，B30在结构上能够模拟3’–SLN。　　7.3’–SLN及其模拟肽B30对小鼠小脑颗粒细胞神经突起生长的影响　　B30模拟肽能够模拟3’–SLN抑制CD24介导的促进小鼠小脑颗粒神经元的突起生长作用，表明B30在该功能上能够模拟3’–SLN。　　8.3’–SLN及其模拟肽B30对小鼠海马神经元突起生长的影响　　(1)3’–SLN能够抑制CD24介导的促进新生小鼠海马神经元突起生长作用。　　(2) B30模拟肽能够模拟3’–SLN抑制CD24介导的促进新生小鼠海马神经元突起生长作用，表明B30在该功能上能够模拟3’–SLN。　　结论：　　1.应用MAL–I凝集素对3’–SLN糖的特异识别作用和噬菌体展示技术筛选出3’–SLN的糖模拟肽B30，该模拟肽在一定程度上可以模拟3’–SLN糖的结构和功能。　　2. CD24对新生小鼠海马神经元轴突生长的促进作用由其自身携带的α(2,3)唾液酸多糖介导。