朱砂叶螨转录组数据分析及表皮蛋白CPAP3-D2基因的功能探讨

来源 :南昌大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jizhidong2009
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朱砂叶螨是一种世界性分布的植食性的重要农业害螨,其防治主要是使用化学药剂,但杀虫剂的不合理施用已经使得该螨对大多数商业杀虫剂均产生了严重的抗性,导致其防控极其困难。几丁质和表皮蛋白是构成昆虫表皮的重要成分,它们相互作用形成一种稳定结构以支撑和保护虫体,在昆虫生长繁殖以及环境适应等生理过程中起着重要作用。国内外大量研究集中于探讨昆虫几丁质的合成和分解代谢以及表皮蛋白作为害虫的防治靶点,以破坏其表皮组成与结构的完整性,为害虫防控提供思路。本研究以朱砂叶螨为研究对象,对其幼螨暴露于不同浓度除虫脲后进行转录组测序并对结果进行分析,以探究该螨对杀虫剂的响应机制;同时克隆获得朱砂叶螨表皮蛋白基因CPAP3-D2的全长后对其表达情况以及该基因的功能进行研究。主要结果如下:(1)通过第二代转录组数据的分析,发现与对照组相比,低浓度(LC50)除虫脲处理组共获得差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)470个,其中157个表达上调,313个表达下调;而高浓度(LC70)除虫脲处理后,共获得49个DEGs,仅有4个DEGs表达上调,45个表达出现下调。GO富集的结果表明,低浓度除虫脲处理后,DEGs主要富集在“离子跨膜转运”、“病毒粒子”、“细胞外区域”、“脂质转运体活性”和“氧化还原酶活性”等过程;高浓度除虫脲处理后,DEGs显著富集在“能量耦合质子运输”、“金属离子结合”、“脂质颗粒”等过程。通过对DEGs的富集通路进行分析,结果显示低浓度除虫脲处理组中,DEGs显著富集的通路有“昆虫激素生物合成”和“溶酶体”,高浓度除虫脲处理组中,DEGs显著富集在“昆虫激素生物合成”、“溶酶体”和“氧化磷酸化”等通路。通过对转录组数据中的解毒酶基因进行分析,共得到34个细胞色素P450基因、17个谷胱甘肽S-转移酶基因、12个乙酰胆碱酯酶基因和9个ABC转运蛋白基因。与对照组相比,低和高浓度除虫脲处理后,朱砂叶螨体内解毒酶基因表达普遍上调。接下来对朱砂叶螨几丁质合成和降解通路的关键基因的表达进行分析,发现低和高浓度除虫脲处理朱砂叶螨幼螨后,几丁质合成和降解通路的基因表达普遍上调。其中,与对照组相比,低浓度除虫脲处理组中几丁质合成通路中TcGFAT2、TcGNA、TcPGM基因的表达出现上调,而高浓度除虫脲处理组中TcHEX1、TcHEX2、TcG6PI2、TcGFAT2及TcUAP基因的表达上调。同时,在几丁质降解通路中,3个几丁质酶基因(TcChT2、TcCHT4、TcCHT8)在低和高浓度除虫脲处理组中均表达上调。(2)朱砂叶螨表皮蛋白TcCPAP3-D2基因全长990bp,编码271个氨基酸,蛋白分子质量为29.67KDa,理论等电点为6.04。TcCPAP3-D2具有CPAP3表皮蛋白家族典型的N端信号肽及三个连续的ChtBD2的保守结构域,没有跨膜结构区。多重序列比对结果表明TcCPAP3-D2序列与其它物种相关序列高度保守,其中,与赤拟谷盗的CPAP3-D2序列一致性最高,为43.54%,与豌豆蚜的相似性最低,为27.99%。系统发育结果表明朱砂叶螨CPAP3-D2基因与昆虫中其他物种的CPAP3-D2基因聚为一支,其系统发育关系为:(((((埃及伊蚊+致倦库蚊)+豌豆蚜)+体虱)+(赤拟谷盗+丽蝇蛹集金小蜂))+朱砂叶螨)。采用RT-qPCR探究朱砂叶螨不同发育阶段CPAP3-D2基因mRNA表达水平,结果表明,TcCPAP3-D2在各个螨态均表达且于若螨时期mRNA表达达到最高值,其表达模式呈现与蜕皮相一致地周期性,即于每次蜕皮前表达达到最高,蜕皮后迅速下降。最后,通过RNA干扰实验,即向朱砂叶螨若螨饲喂dsTcCPAP3-D2溶液,48h后朱砂叶螨若螨的死亡率高达80%;RT-qPCR结果表明,RNAi后,与对照组相比,朱砂叶螨CPAP3-D2基因的mRNA表达显著下调(P<0.05),大约为对照组的1/5,表明CPAP3-D2基因可能在朱砂叶螨表皮形成过程中发挥着重要的作用。综上所述,本论文通过二代转录组测序技术对朱砂叶螨响应除虫脲暴露的数据进行分析,从几丁质代谢的角度探讨朱砂叶螨对杀虫剂的响应机制;同时,分析了朱砂叶螨表皮蛋白CPAP3-D2基因的序列特征以及表达,并对沉默该基因后的生物学特性进行了探究。本文从几丁质和表皮蛋白两个方面共同探讨了朱砂叶螨的表皮代谢的内容,为该螨的防控提供新的策略和思路。
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