目的:自在原核生物中发现线性质粒以来,对于线性质粒的探索一度成为原核生物研究的热点,其作为独立于染色体基因组外的遗传单位,在细菌耐药性及致病方面发挥了重要作用。质粒p BSSB1是目前为止在伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)中发现的唯一的一种线性质粒。本课题组对线性质粒p BSSB1其上两个基因的功能展开研究,进一步探索该线性质粒在伤寒沙门菌中所发挥的作用。方法:1.伤寒沙门菌LP002、LP008基因高表达菌株、缺陷株及异源表达菌株的构建。构建p BAD-LP008重组载体,鉴定正确后,用阳性重组质粒和空质粒电击转化伤寒沙门菌野生株(S.Typhi GIFU10007),作为LP008基因高表达菌株(WT-LP008)和空质粒对照株(WT-p BAD);阳性质粒及空载体电转化S.Typhi Ty2感受态作为LP008基因异源表达株(Ty2-LP008)及异源表达对照株(Ty2-p BAD)。LP008及LP002基因缺陷株的制备则是将同源重组片段连接于自杀质粒p GMB151,将阳性质粒电击转化入野生株后利用蔗糖平板筛选最终的缺陷菌株(记作△LP002或△LP008)。2.p BSSB1 LP008蛋白的表达及纯化。构建p ET28b-LP008重组载体并将构建成功的阳性载体热击转化入E.coli JM109(DE3)感受态以获取阳性LP008蛋白表达株。用IPTG诱导阳性菌株中LP008蛋白的表达,超声破菌后取上清采用Ni柱亲和层析的方法分离及纯化目的蛋白。3.各菌株在不同条件下的生长曲线测定。以生长时间为横坐标,OD600值为纵坐标绘制生长曲线,对比所制备的各菌株和对照株生长情况的差异。4.生物膜合成分析。在TSB培养基中培养LP008高表达菌株及对照株至对数期,并将菌液接种至96孔板中静置培养以利于细菌在固体表面形成生物膜。静置培养后弃去菌液并用结晶紫染液对生物膜进行染色,经蒸馏水漂洗后用冰醋酸溶解孔内结晶紫染料,其吸光度与生物膜的生成量呈正比。5.各菌株的动力实验。将上述构建的各菌株和其对照株培养至对数期,取野1μl菌液点种于0.3%琼脂等渗半固体LB培养基,37℃培养12 h后测量动力圈直径,比较细菌的动力。6.上皮细胞侵袭实验。将上述构建的各菌株和其对照株培养至对数期后与He La细胞共孵育,比较各个菌株对于He La细胞粘附能力和侵袭能力的差异。7.巨噬细胞内存活试验。将上述构建的各菌株和其对照株培养至对数期后与THP-1细胞共孵育,比较各个菌株对于巨噬细胞对细菌的吞噬水平和细菌在巨噬细胞中的存活能力的差异。8.各表型调节机制分析。提取RNA并将其逆转录为c DNA,通过q RT-PCR分析诸多表型变化的机制和其调控作用的靶基因。9.LP008异源表达菌株的基因芯片分析。将LP008异源表达菌株和对照株培养至对数晚期(OD600 0.8),加入阿拉伯糖诱导后提取总RNA,并将RNA逆转录为c DNA,同时用荧光素进行标记,标记后的c DNA与基因组芯片探针杂交,经扫描后将荧光信号被数据化,处理分析数据后对比LP008基因高表达菌株和空质粒对照株的基因表达谱差异。10.凝胶阻滞试验。将纯化的LP008蛋白与靶基因的启动子区域序列于室温共孵育30 min,用6%丙烯酰胺非变性胶电泳检测LP008蛋白与DNA片段的结合情况。结果:1.成功构建LP008基因高表达菌株(WT-LP008)、LP008基因异源表达菌株(Ty2-LP008)、LP002基因缺陷株(△LP002);LP008基因缺陷株(△LP008)制备失败。2.成功构建LP008蛋白的重组表达载体,获取纯化的LP008-His6蛋白。3.生长曲线表明,在正常及酸、氧、高渗应激条件下,△LP002和野生株并无明显差异;WT-LP008在正常条件下相比对照株,生长先呈落后趋势而后反跳。4.生物膜生成分析结果说明,高表达LP008基因后伤寒沙门菌的生物膜合成量明显降低。5.动力实验表明,△LP002的动力比野生株无明显变化,而WT-LP008的动力较对照株明显下降。6.与野生株相比,LP002缺陷株在对数早期对He La细胞的侵袭力有所增强,而在对数晚期LP002缺陷株的侵袭力有明显下降。LP008高表达株相比对照株,对于He La细胞的侵袭能力明显下降。7.与野生株相比,LP002缺陷株在巨噬细胞内的生存能力明显下降。8.通过q RT-PCR分析,LP008高表达菌株可以下调fhl D、fli A、fli L、flj A、flj B、inv F、iag A、pil S、csg D的表达水平从而发挥调节作用。9.基因芯片结果显示,在S.Typhi Ty2中异源表达LP008基因后,和对照株相比基因组各基因表达并没有明显变化。10.凝胶阻滞试验结果显示LP008蛋白可结合于靶基因启动子序列,但LP008蛋白对于DNA片段的结合并没有特异性。结论:伤寒沙门菌的线性质粒LP002和LP008基因在伤寒沙门菌致病过程的不同方面均发挥了各自的作用。LP008基因主要调节伤寒沙门菌的动力、生物膜形成、细胞侵袭力;而LP002基因主要与上皮细胞侵袭及巨噬细胞内存活力有关。本文对于线性质粒功能的研究为今后进一步探索其功能奠定了良好的基础。