目的:根据国际疼痛研究会(IASP)对疼痛定义,疼痛可分为两种成分,即痛的感觉分辨(sensory-discriminative)与痛的情绪反应(emotional-affective dimensions)。痛的感觉分辨感受痛刺激的性质、强度和位置等属性;痛的情绪反应包括焦虑、厌恶、恐惧等不良情绪。大量研究表明,疼痛的感觉成分和情绪反应是由不同的中枢机制作用产生,并且由不同的神经传导通路介导。人类和动物的行为学、电生理学和脑成像等相关治疗、实验结果已提供证据,位于大脑额叶内侧的前扣带皮层(anterior cingulate cortex,ACC),尤其是其吻侧部(rostral ACC,r ACC)参与疼痛诱发的厌恶情绪的形成,在不良情绪引起的行为表现等方面起着重要作用。切除大鼠双侧的r ACC可以避免痛情绪引起的条件性位置回避(conditioned place avoidance,CPA)。一些临床和动物实验的研究也表明,电针刺激可以缓解人和动物的痛情绪反应;而已有的资料和我们过去的工作显示,传统的中医针灸或现代的电针治疗可激活体内的阿片受体缓解疼痛。阿片受体主要有3型:μ-阿片受体、δ-阿片受体、κ-阿片受体。我们之前的研究已经证实电针可通过激活μ-受体缓解大鼠的痛情绪,但是否能通过激活δ-阿片受体缓解痛情绪并不清楚,本研究就此进行深入探讨。本实验使用的动物模型为大鼠脚掌注射完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)诱导的条件性位置回避(C-CPA)模型,结合在r ACC脑区内分别给予不同浓度δ-阿片受体拮抗剂Naltrindole,测量C-CPA行为反应和热痛行为反应(热缩足反射潜伏期,PWL),探讨此实验中拮抗r ACC内δ-阿片受体是否可以反转电针缓解痛情绪的作用。方法:1.建立由CFA诱导的慢性持续性炎性疼痛动物模型取250-270g成年雄性SD(Sprague Dawley)大鼠,左侧足底皮下注射0.08ml完全弗氏佐剂(CFA),建立炎症性疼痛模型。对照组为左侧足底皮下注射0.08ml生理盐水(NS)组和足底未注射组。2.建立由CFA诱导的条件性位置回避(C-CPA)模型将实验大鼠随机分为3组:(1)足底未注射对照组;(2)足底注射生理盐水(NS)对照组;(3)足底注射CFA(0.08ml)实验组。n=6~8只/组。将由注射CFA引起的慢性炎症性疼痛作为特定的条件,并与可分辨的环境耦合,建立条件性位置回避(C-CPA)模型,比较大鼠脚掌注射CFA前后在“疼痛环境”中停留的时间,并计算回避分数(CPA Score),判断大鼠是否产生CPA反应。3.电针刺激取成年雄性SD大鼠,随机分为真电针组(electroacupuncture,EA)和假电针组(sham EA)。在脚掌注射NS/CFA后,将针灸针插入大鼠双侧环跳穴(GB30),用胶带固定于大腿。通过导线将针灸针与电针仪相连,通电后开始电针刺激。4.检测热缩足反射潜伏期(Paw Withdrawal Latency,PWL)在CPA的第一天和第三天分别检测各组大鼠的PWL,观察CFA对大鼠的热痛行为反应的影响,以及r ACC注射不同剂量naltrindole并给予电针刺激后大鼠PWL数值的变化。5.通过western-blot检测δ-阿片受体和NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达水平在行为检测实验完成后,取大鼠r ACC区组织样本,通过western-blot技术检测各组大鼠r ACC区内δ-阿片受体和NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达水平。6.实验分组根据左侧足底皮下注射CFA/NS、r ACC区注射naltrindole/NS和双侧环跳穴真假电针刺激将大鼠分为以下8组。(1)足底注射NS,r ACC注射NS,EA;(2)足底注射NS,r ACC注射NS,sham EA;(3)足底注射CFA,r ACC注射NS,EA;(4)足底注射CFA,r ACC注射NS,sham EA;(5)足底注射NS,r ACC分别注射1/2.5/5/10μg/μl naltrindole,EA;(6)足底注射NS,r ACC分别注射1/2.5/5/10μg/μl naltrindole,sham EA;(7)足底注射CFA,r ACC分别注射1/2.5/5/10μg/μl naltrindole,EA;(8)足底注射CFA,r ACC分别注射1/2.5/5/10μg/μl naltrindole,sham EA。结果:1.足底注射CFA,大鼠的热痛行为发生改变大鼠左侧足底注射CFA组、注射NS组和未注射对照组比较,注射CFA组大鼠PWL在处理后第三天与第一天基础值相比明显缩短(post 7.23±1.65s VS pre12.54±0.72s,P<0.05,n=6),注射NS组(post 15.62±2.99s VS pre 14.35±1.05s,P>0.05,n=6)和未注射组(post 13.66±2.22s VS pre 14.27±1.05s,P>0.05,n=6)的PWL与各自基础值相比,没有明显的变化。说明后脚掌注射CFA可引起大鼠炎症性疼痛。2.足底注射CFA诱导大鼠产生CPA反应足底未注射对照组(post 275.18±34.35s VS pre 324.83±34.35s,P>0.05,n=6)和足底注射生理盐水组(post 287.32±41.35s VS pre 320.42±65.55s,P>0.05,n=6),大鼠第三天在“疼痛环境”匹配室的停留时间和第一天相比都没有显著性差异,两组回避分数间没有差别(P>0.05)。足底注射CFA组(post 193.83±69.4s VS pre315.3±34.6s,P<0.05,n=6),大鼠第三天在“疼痛环境”匹配室停留的时间明显小于第一天,因而对环境产生厌恶反应。说明大鼠后脚掌注射CFA可引起CPA反应,即产生痛情绪。3.电针刺激可缓解CFA诱导的大鼠条件性位置回避(CPA)反应大鼠左侧足底注射CFA后,在双侧环跳穴分别给予真电针刺激(EA)或者假电针刺激(sham EA)。大鼠足底注射CFA,假电针刺激后,在“疼痛环境”停留的时间第三天明显少于第一天,有显著性差异,(post 174.67±31.03s VS pre323.03±84.94s,P<0.05,n=6);真电针刺激后,大鼠在“疼痛环境”中停留时间第三天与第一天相比没有统计学差异,(post 370.40±80.34s VS pre 400.57±81.03s,P>0.05,n=6)。真电针组(EA)回避分数明显小于假电针组(sham EA),两组有统计学差异(EA组-77.23±35.58s VS sham EA组-148.4±31.15s,P<0.05,n=6)。说明电针刺激可以缓解CFA诱导的CPA反应。大鼠左侧足底注射NS后,在双侧环跳穴分别给予真电针刺激(EA)或者假电针刺激(sham EA)。两组大鼠在“疼痛环境”中停留时间第三天和第一天相比均没有统计学差异,假电针组(post 306.63±30.25s VS pre 309.8±35.62s,P>0.05,n=6);真电针组(post 278.34±41.07s VS pre 315.16±51.77s,P>0.05,n=6)。两组回避分数相比也没有统计学差异(NS+EA组-30.67±6.36s VS NS+sham EA组12.33±1.86s,P>0.05,n=6)。说明电针刺激不会引起正常大鼠的厌恶或者奖赏反应。大鼠左侧足底注射CFA后,在双侧环跳穴分别给予真电针刺激(EA)或者假电针刺激(sham EA),第三天测量大鼠的热痛行为反应,PWL之间没有统计学差异,真电针组(post 8.97±1.09s VS pre 7.34±0.52s,P>0.05,n=6);假电针组(post8.53±0.86s VS pre 7.63±0.26s,P>0.05,n=6)。电针刺激双侧环跳穴不影响由CFA引起的大鼠慢性炎症性热痛行为。4.r ACC内注射δ-阿片受体拮抗剂naltrindole反转了电针刺激缓解痛情绪的作用足底注射CFA,r ACC内注射δ-阿片受体拮抗剂naltrindole或NS,不进行电针刺激。大鼠第三天在“疼痛环境”中停留时间与第一天相比:naltrindole组(post241.5±26.32s VS pre 373.68±35.65s,P<0.05,n=7);NS组(post 183.63±22.60s VS pre 318.67±37.61s,P<0.05,n=6);naltrindole组和NS组回避分数没有统计学差异(-92.76±12.63s VS-70.42±11.80s,P>0.05,n=6)。r ACC内注射naltrindole本身不会影响大鼠的CPA反应。足底注射CFA,r ACC内注射δ-阿片受体拮抗剂naltrindole或NS,进行电针刺激。大鼠第三天在“疼痛环境”中停留时间与第一天相比:naltrindole组(post287.50±67.03s VS pre 388.37±63.10s,P<0.05,n=11);NS组(post 372.75±71.35s VS pre 392.76±66.7s,P>0.05,n=11);naltrindole组回避分数明显大于NS组,有统计学差异(-100.90±s32.45 VS-20.01±26.53s,P<0.05,n=11)。r ACC内注射naltrindole反转了电针刺激缓解痛情绪的作用。大鼠左侧足底注射CFA,r ACC内注射不同浓度1/2.5/5/10μg/μlδ-阿片受体拮抗剂naltrindole,进行电针刺激,不同浓度naltrindole反转电针刺激缓解痛情绪的作用效果不同。大鼠在“疼痛环境”中停留的时间第三天与第一天相比:1μg/μlnaltrindole组没有统计学差异(post 304.6±40.3s VS pre 293.0±25.28s,P>0.05,n=11);2.5μg/μl naltrindole组没有统计学差异(post 284.3±62.62s VS pre375.3±28.0s,P>0.05,n=8);5μg/μl naltrindole组有统计学差异(post 287.5±35.28s VS pre 388.4±31.08s,P<0.05,n=11);10μg/μl naltrindole组有统计学差异(post252.0±29.46s VS pre 319.1±12.24s,P<0.05,n=11)。在r ACC内注射1/2.5μg/μl naltrindole并未观察到反转电针缓解痛情绪的作用,在r ACC内注射5/10μg/μl naltrindole则反转了电针缓解痛情绪的作用。5μg/μl naltrindole反转电针缓解痛情绪作用更强,但与10μg/μl naltrindole的作用相比没有统计学差异。大鼠左侧足底注射CFA,r ACC内注射1/2.5/5/10μg/μl naltrindole的各组大鼠PWL值与r ACC内注射NS相比,都没有显著性差异(P>0.05)。各组PWL值为:CFA+NS组8.94±1.26s,n=7;CFA+1μg/μl naltrindole组9.22±1.15s,n=6;CFA+2.5μg/μl naltrindole组9.0±0.60s,n=8;CFA+5μg/μl naltrindole组10.36±1.44s,n=6;CFA+10μg/μl naltrindole组9.96±1.40s,n=6。r ACC内注射naltrindole不影响CFA引起的热痛行为。5.通过westerm-blot检测r ACC内δ-阿片受体和磷酸化的NR1/NR2A/NR2B亚基的表达水平大鼠足底注射CFA,r ACC内注射NS,真电针刺激组(CFA+NS+EA),与足底注射CFA,r ACC内注射NS,假电针刺激组(CFA+NS+sham EA)相比,r ACC内δ-阿片受体表达量增多,有统计学意义(P<0.05)。电针刺激可以激活大鼠r ACC内的δ-阿片受体。大鼠足底注射CFA,r ACC内注射NS,假电针刺激组(CFA+NS+sham EA),与足底注射NS,r ACC内注射NS,假电针刺激组(NS+NS+sham EA)相比,r ACC内NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化水平显著升高,有统计学意义(P<0.05)。CFA致大鼠r ACC内NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达量增高。大鼠足底注射CFA,r ACC内注射NS,真电针刺激组(CFA+NS+EA),与足底注射CFA,r ACC内注射NS,假电针刺激组(CFA+NS+sham EA)相比,r ACC内NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化水平显著降低,有统计学意义(P<0.05)。大鼠电针刺激可以下调CFA诱导的r ACC内NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达。结论:1.电针刺激激活r ACC内δ-阿片受体,从而缓解CFA诱导的痛情绪反应。2.拮抗r ACC内δ-阿片受体可反转电针刺激缓解CFA诱导的痛情绪反应,5/10μg/μl的naltrindole反转了电针缓解痛情绪的作用,而1/2.5μg/μl的naltrindole并未起到反转作用。3.CFA致大鼠炎症性痛模型r ACC内NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达水平显著上调。4.电针刺激可以激活r ACC内的δ-阿片受体,下调NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达水平,从而缓解痛情绪。