论文部分内容阅读
背景布鲁菌病(简称布病),是由布鲁菌(简称布菌)引起的一种严重的人畜共患传染病。人感染布菌后容易转为慢性,引起多器官损伤。目前布病的实验室诊断主要以血清学检测抗体为主,存在不同程度的交叉反应,不能真实地反映患者胞内的携菌情况。布病的病原学检测以菌培养作为“金标准”,但其分离率较低,操作存在较大的生物安全风险。核酸检测也是当前的研究热点,其操作的简便性尚不能满足大多临床诊断要求。直接检测布病患者细胞内的病原体或布菌抗原,对于布病的诊断和治疗效果评价具有重要意义。然而,这一领域的研究报道尚不多见。目的本研究拟通过制备、筛选和鉴定特异性布菌外膜蛋白单克隆抗体,建立针对布病患者外周血单个核细胞(PBMCs)内布菌抗原的流式细胞检测方法,用于布病临床治疗效果评价。方法1.材料重组布菌外膜蛋白Omp31、Bp26和Omp25;布菌外膜蛋白特异性单克隆抗体及其杂交瘤细胞;灭活布菌菌体,包括牛种(B.abortus 2308、104M和S19菌株),羊种(B.melitensis M5-90)和猪种(B.suis S2);异硫氰酸荧光素(FITC),藻红蛋白(r-PE)标记试剂盒。2.研究对象52名布病患者的全血样本作为实验组,55名健康献血者的全血样本作为健康对照组。新鲜分离布病患者与献血者PBMCs。3.实验方法3.1纯化制备单克隆抗体:杂交瘤细胞经有限稀释法重新克隆,收集单克隆细胞后腹腔接种小鼠,制备的腹水用Protein G柱纯化,获得多个批次的单抗,经Nanodrop2000测定浓度,SDS-PAGE鉴定纯度。3.2筛选及鉴定单克隆抗体:ELISA鉴定纯化后单抗的效价和亲和力。多肽ELISA用于Omp25的5株单抗抗原表位识别的鉴定,双抗夹心ELISA筛选其配对抗体。3.3特异性单抗与常见三种布菌(牛种、羊种和猪种)的反应:利用Western blot(WB)、ELISA方法对牛、羊、猪三种布菌菌种进行鉴定。3.4流式细胞术(FCM)检测细胞内布菌抗原:用异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(r-PE)标记单抗,通过FCM检测真核表达载体转染的细胞,以及健康献血者和布病患者的单个核细胞(PBMCs),分析该方法的临床应用价值。结果1.针对布菌Omp31、Bp26和Omp25筛选及制备出了一批效价约为1:20万,纯度大于90%的单克隆抗体,适用于ELISA、WB及细胞免疫荧光(IFS)等免疫学方法对多种布菌抗原的检测。2.细致分析与鉴定了 5株Omp25单抗的识别表位,其中4株单抗(4A12和4F10、8F3、2B10)识别三个不同线性表位(P2、P4和P7),1株单抗(6C12)识别一个半构象表位。实验优化选出8F3/6C12-HRP和8F3/4A12-HRP两组配对抗体用于ELISA检测布菌抗原,其中6C12和4A12适合作为检测抗体,8F3适合作为捕获抗体。3.选用6C12单抗进行荧光素标记,FCM检测布病患者PBMCs携带布菌的频率。结果显示PBMCs布菌阳性频率>1%(设定的Cutoff本底值)的布病患者为42.3%(22/52),其FCM检测的PBMCs阳性频率与携带布菌数呈正相关。结论本研究制备了用于布菌外膜蛋白免疫检测的多株单克隆抗体,以Omp25特异性单抗6C12建立了流式细胞术用于检测布病患者外周血PBMCs中布菌抗原,为布病诊断或临床治疗效果评价提供了新方法。创新之处首次建立了布病患者PBMCs内布菌流式细胞测定方法并用于布病患者抗菌治疗效果评价,该研究成果已在 Frontiers in Cellular and Infection Microbiology(2020)发表。