论文部分内容阅读
【研究背景】天疱疮（Pemphigus）是一种慢性自身免疫性大疱性皮肤病,包括四个主要临床类型,即寻常型、落叶型、红斑型和增殖型天疱疮,其他罕见类型包括副肿瘤型天疱疮、Ig A型天疱疮、疱疹样天疱疮、药物性天疱疮及新生儿天疱疮等。其中寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris,PV）是最常见的类型,占所有天疱疮发病的70%。天疱疮的发病机制为患者产生针对角质形成细胞（keratinocyte,KC）间的连接结构——桥粒的主要成分——桥粒芯蛋白（desmoglein,Dsg）的致病性自身抗体Ig G,包括anti-Dsg1、anti-Dsg3等,自身抗体结合到KC上,触发信号传导并产生级联反应,Dsg蛋白构象改变,功能异常,使KC间连接消失,导致棘层松解。但详细松解机制包括如何触发信号传导、桥粒中哪些结构蛋白发生功能变化并参与水疱形成还有待深入研究。应用糖皮质激素联合免疫抑制剂仍是目前治疗天疱疮的首选,长期系统使用糖皮质激素的副作用大,驱使我们寻找一种更有效的治疗PV的方法。他克莫司（FK506）作为一种钙调磷酸酶抑制剂,可降低T细胞的活化。研究发现,局部或口服使用他克莫司联合系统使用糖皮质激素可以治疗PV。此外,既往有研究使用天疱疮小鼠模型提示FK506抑制了小鼠抗Dsg3抗体的产生。然而,到目前为止,还没有在细胞水平上对FK506治疗PV的作用及机制进行研究。自身抗体诱导棘层松解的信号通路改变是目前研究天疱疮发病机制的新热点,因此已有大量关于PV自身抗体（PV-Ig G）和自身抗原结合后下游信号通路改变的研究。我们前期研究表明PV的发病机制涉及p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）和热休克蛋白（Heat shock protein,HSP）27通路的激活。【研究目标】通过建立PV细胞模型,以PV-血清为干预因素、他克莫司（FK506）和丙酸氯倍他索（clobetasol propionate,CP）分别为保护因素,探讨PV-血清孵育的HaCaT细胞间连接变化、桥粒结构相关蛋白（Dsg、斑菲素蛋白（plakophilin,PKP）3等）的变化,以及p38MAPK信号通路的表达情况,为进一步阐述天疱疮棘层松解机制提供依据,并为寻找新的治疗靶点服务。【研究内容】1.检测FK506和CP在HaCaT细胞中的最佳孵育浓度;2.将HaCaT细胞与含5%PV-血清的高糖DMEM培养基共培养,建立PV细胞模型,探讨PV-血清对HaCaT细胞间连接变化及Dsg、PKP3表达的影响;3.加入FK506、CP后对PV-血清孵育的HaCaT细胞间连接及Dsg、PKP3蛋白表达的影响;4.检测PV-血清孵育HaCaT细胞后磷酸化p38MAPK及磷酸化HSP27的表达,以及加入FK506后对上述磷酸化表达的影响;5.观察沉默HSP27后PV-血清对Dsg3蛋白表达的影响;6.ELISA方法检测PV血清IL-36γ的表达,免疫组化方法检测PV皮损IL-36γ表达。【实验方法】1.实验分组:（1）正常组（Con）:5%FBS高糖DMEM培养基;（2）健康血清组（normal healthy sera,NH）:5%混合健康血清加入高糖DMEM培养基中;（3）PV-血清组（PV）:5%混合的PV-血清加入高糖DMEM培养基中;（4）AK23（阳性对照）:AK23是一种致病性的鼠源性抗Dsg3单克隆抗体,与细胞共孵育时浓度为1μg/m L,加入5%FBS高糖DMEM培养基中;（5）药物处理:在上述条件下加入100n M FK506、1μM CP及1μM p38MAPK抑制剂SB203580。2.采用CCK8、Westernblot、细胞解离实验、免疫荧光染色、免疫组化染色和ELISA等方法。【研究结果】1.FK506及CP对HaCaT细胞增殖活性的影响。使用不同浓度的FK506和CP与HaCaT细胞共孵育24h后,CCK8法检测FK506和CP对HaCaT细胞生长和活性的影响。与正常对照组比较,FK506在0.01μM-10μM浓度下对HaCaT细胞无明显的细胞毒作用（p0.001）,0.1μM-10μM的CP对HaCaT细胞的增殖活性无显著影响（p<0.05）。本实验中,FK506的使用浓度为100n M,CP的使用浓度为1μM。2.PV-血清和AK23共孵育后会导致HaCaT细胞间连接丧失和Dsg3的耗竭。细胞解离实验提示,正常对照条件（Con）和健康血清（NH）培养的HaCaT细胞间保持紧密连接,而应用含PV-血清或AK23的DMEM培养基孵育24小时诱导细胞连接减弱或消失。Westernblot结果提示,与Con组和NH组相比,加入PV-血清和AK23后导致Dsg3表达下调,PKP3表达增加。免疫荧光染色结果表示,Con组和NH组HaCaT细胞表面Dsg3荧光为强线性表达,而PV组和AK23组Dsg3荧光强度减弱,转变为颗粒转和碎片状表达。3.FK506及CP可抑制PV-血清导致的HaCaT细胞间失连接及Dsg3内吞。用细胞解离实验提示,PV组和AK23组HaCaT细胞经FK506和/或CP处理后,细胞碎片数量显著减少（p<0.05）。Westernblot结果显示,PV组和AK23组HaCaT细胞中Dsg3的表达明显降低,而经FK506和/或CP处理后,总Dsg3的表达升高。免疫荧光染色显示,PV组和AK23组与FK506和/或CP共孵育后细胞表面Dsg3荧光强度增加,AK23组甚至可以恢复线性分布。4.FK506可逆转PV-血清所致的HSP27磷酸化。用PV-血清或AK23处理HaCaT细胞,Westernblot检测PV-血清和AK23作用HaCaT细胞后磷酸化-p38MAPK（p-p38MAPK）和磷酸化-HSP27（p-HSP27）活性峰值。p38MAPK活性第一个高峰出现在0.5-2h,第二个小高峰出现在24h。PV-血清和AK23激活p-HSP27的峰值出现在0.5h前后。我们进一步分析FK506对PV-血清诱导的p38MAPK、HSP27磷酸化的影响。用100n M FK506或1μM p38MAPK抑制剂SB203580预处理HaCaT细胞2小时,然后用PV-血清或AK23处理1小时。FK506及SB203580能显著阻断HSP27的磷酸化,但不能降低p38MAPK磷酸化水平。5.沉默HSP27蛋白表达后,不能抑制PV-血清导致的Dsg3内吞。为了研究HSP27蛋白在PV发病机制中的影响,我们使用si RNA沉默HSP27在HaCaT细胞中的表达。通过Westernblot和免疫荧光检测确认HSP27 si RNA的沉默效率。在转染HSP27 si RNA 48h后更换PV-血清培养基继续孵育24h,Westernblot及免疫荧光结果提示沉默HSP27后不能抑制PV-血清所致Dsg3耗竭和内吞。6.IL-36γ在PV血清及皮损表达中表达增加。ELISA结果提示,PV患者血清IL-36γ表达较正常血清明显升高（4844±1156 vs 206.7±12.62（pg/m L）,t=4.013,p=0.0070）。免疫组化结果提示,与正常组皮肤相比,PV皮损组织上皮表达IL-36γ增加,主要分布在棘层、基底层,而正常皮肤上皮几乎不表达或者在基底层有散在数个表达。免疫组化阳性细胞表达强弱用平均积分光密度值（IOD/Area）来表示。结果提示PV患者皮损IOD/Area值较正常组增加（0.087±0.010 vs 0.033±0.012,t=2.972,p=0.0073）。【结论】1、PV-血清诱导HaCaT细胞Dsg3内吞和细胞失连接,这可能与PV-血清触发p38 MAPK和HSP27的快速磷酸化有关;2、FK506可抑制PV-血清致Dsg内吞和细胞失连接效应,且与显著降低PV-血清诱导的HSP27（而不是p38MAPK）磷酸化有关,未发现FK506对PKP3表达的影响;3、si RNA介导的HSP27沉默未发现影响PV-血清诱导的Dsg3的内吞,提示PV发病机制存在通路依赖和非依赖性。此外,PV-血清诱导PKP3表达上升以及HSP27磷酸化等在PV发病机制中作用需进一步研究;4、IL-36γ在PV血清及皮损中表达增加,但其在PV发病中的作用需要进一步研究。