目的:采用RNA-Seq技术和生物信息学分析的方法,研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)向睾丸间质细胞(LC)分化中的信号通路及基因表达差异,探索其分化机制。方法:将经纯化鉴定的骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种于培养皿,设置A组为对照组,B组为实验组。实验组添加bFGF+PDGF+hCG诱导BMSCs向LC分化。诱导21d,分别提取A组0天(BMSCs)、B组7d、14d、21d以及分化成功的睾丸间质细胞(Leydigs cell)的RNA进行转录组测序,并根据mRNA测序结果进行以下分析:1.差异筛选标准。使用最新的转录本组装软件String Tie对reads进行拼接组装,并对拼接转录本进行注释。使用R语言的Ballgown包对StringTie组装和定量完毕的mRNA进行差异分析设置筛选条件为:|log2FC|>2。2.筛选差异表达基因。基于Gene ontology数据库以及KEGG通路数据库对差异表达基因进行功能以及通路富集分析。3.差异表达分析。我们使用R包Ballgown进行差异表达分析和可视化绘图。RNA的表达水平主要采用RPKM或者FPKM度量RNA表达的丰度值。Ballgown因为在计算RNA的表达量采用归一化的FPKM值,避免一些假阳性的结果和高丰度表达的RNA对中低丰度RNA表达的影响。结果:1.通过实验得到了睾丸间质细胞(Leydig cell),分化过程中7d、21d时期的各细胞形态符合分化过程,且得到的睾丸间质细胞(Leydig cell)能够分泌睾酮。2.通过比较对照组A(BMSCs)、实验组(7d、21d)及LC的表达数据,共获得表达基因7546个,其中持续上调的基因356个,持续下调的基因960个。3.通过对持续上调和下调基因进一步进行GO富集性分析,这些差异基因所涉及生物过程包括信号通路、信号通路的调控、大分子代谢、细胞周期或细胞分裂等。KEGG富集性分析主要关联的关键信号通路244条,其中富集数目较多的信号有:Wnt信号通路、成纤维细胞生长因子信号通路、BMP信号通路、Notch信号通路等。在所有的信号同路中,Wnt信号通路富集的数目最多。4.通过对Wnt信号通路相关的所有基因(130)进行筛选,符合上调和下调趋势的基因共22个,表达持续上升的基因有:Dact3、DKK3,Gli3、Ddit3等,表达持续下降的基因有:Lrp6,Wnt5a,Depdc1b、Smad3等。表达量差异10倍以上的基因有:Wnt5a,Depdc1b、DKK3,Gli3。结论:BMSCs向LC分化的信号通路中存在Wnt信号通路,可能的关键基因有Wnt5a,Depdc1b、DKK3,Gli3。