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中东呼吸综合征（MERS）是由中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-Co V）引起的一种呼吸道疾病。自2012年9月出现首例感染者以来,确诊人数在持续增加。截止到2021年3月11日,全球共报道了2574例确诊病例,其中886例死亡,死亡率约为34%。单峰骆驼是MERS-Co V传播的主要中间宿主,是人类感染MERS-Co V的源头,可向人类反复传播病毒,致使在骆驼农场、屠宰场和市场上工作的人们长期处于潜在感染的风险中。由于单峰骆驼制品是中东地区的主要农畜产品,很难通过禁止骆驼制品交易或扑杀的方式防止病毒从骆驼外溢感染人类,加之目前尚无针对MERS-Co V的疫苗,因此及时有效的早期检测是防范MERS大流行的重要手段之一。WHO推荐RT-q PCR方法作为MERS-Co V实验室检测金标准。在诸多核酸检测方法中,RT-q PCR方法在灵敏度和技术成熟度方面具有绝对的优势;然而,由于对精密仪器的依赖,导致资源匮乏地区不得不将采集的样品运送至仪器配备齐全的实验室进行检测,延长了结果的获取时间,不利于疫病早期的控制和感染患者的及时救治。本研究基于MS2噬菌体衣壳蛋白可特异性包裹由噬菌体操纵子RNA序列（Pac）介导的m RNA,制备了内含MERS-Co V RNA的噬菌体样颗粒（PLP）用作MERS-Co V核酸检测方法的质控品。将等温扩增技术和免疫层析试纸相结合,建立了一种适用于基层实验室的MERS-Co V Up E、N基因的核酸可视化检测方法（RT-RPA-VF）。此外,我们将家用便携式血糖仪（PGM）应用于RNA病毒的检测,建立了基于PGM的MERS-Co V Up E基因核酸数字化检测方法（ND-PGM）。主要研究结果如下:1、MERS-Co V核酸检测质控品的制备。将噬菌体衣壳蛋白二聚体基因、成熟酶蛋白基因、Pac突变体以及MERS-Co V Up E和N基因克隆于p ACYCDuet-1载体中,构建了包装MERS-Co V PLP的单质粒双表达系统。并通过大肠杆菌表达系统成功制备了4种内含Up E、N基因序列的MERS-Co V PLP。经耐酶性试验、RT-q PCR检测证明纯化后的PLP能保护内部MERS-Co V RNA免受RNase酶的降解,可用作MERS-Co V核酸检测方法的质控品,及用于制备模拟临床样品评价RT-RPA-VF和ND-PGM方法;2、MERS-Co V RT-RPA-VF方法的建立。针对WHO推荐的MERS-Co V核酸检测靶标Up E和N基因,设计了适用于人和单峰骆驼源的特异性RPA引物和探针组。建立了MERS-Co V Up E、N基因的RT-RPA-VF方法,其中Up E方法在33℃条件下,30 min内可检测到1.2×101 copies/μL的MERS-Co V RNA,N方法可在35℃条件下,30 min内检测到1.2 copies/μL的MERS-Co V RNA;使用210份混有MERS-Co V PLP的人、骆驼、羊驼呼吸道拭子样品和30份阴性拭子样品评价该方法,相较于RT-q PCR方法,N方法的敏感性和特异性均达到100%,而Up E方法的特异性为100%,敏感性为86%。因此,我们建议将N方法用于MERS-Co V的筛查,Up E方法用于MERS-Co V的确诊。3、基于便携式PGM的MERS-Co V Up E基因数字化检测方法的初步探索。利用蔗糖转化酶能催化蔗糖生成葡萄糖的原理,本研究制备了标记有蔗糖转化酶的MERS-Co V检测探针,并与RPA技术相结合,实现了对MERS-Co VRNA的数字化检测。ND-PGM方法在37℃条件下,2 h内可检测到1.2×102 copies/μL MERS-Co V RNA,且与冠状病毒SARA-Co V-2、HKU4、TGEV、PEDV、FCo V等无交叉反应。210份混有MERS-Co V PLP的人、骆驼、羊驼呼吸道拭子样品和30份阴性拭子样品评价该方法,相较于RT-q PCR方法,ND-PGM方法的敏感性为75.2%,特异性为100%。综上所述,本研究制备了内含MERS-Co V RNA的PLP质控品,为有效监测MERS-Co V核酸检测质量提供重要的指导和保障。建立了一种适用于人和单峰骆驼源MERS-Co V的RT-RPA-VF方法,其具有快速、无特殊设备依赖性、高敏感性、高特异性的优点,适用于资源匮乏地区的基层实验室。探索了基于家用PGM的MERS-Co V Up E基因核酸数字化检测方法,其较低的成本有望应用被于疑似感染动物的筛查。