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目的近年的研究和临床实践均发现氯胺酮对认知功能有影响。临床上患者可出现术后认知功能障碍(Postoperative Cognitive Dysfunction,POCD),即患者经过麻醉和手术后出现人格、社交能力变化及认知功能障碍为主要症状的神经系统并发症。社会上滥用者的认知功能损害亦有报道。目前认为,通过不同的作用机制,氯胺酮可对认知功能产生影响。其中,氯胺酮可通过拮抗NMDA受体,引起细胞外谷氨酸浓度增加,引起兴奋/抑制平衡失调、谷氨酸兴奋性毒性等。有研究提示,II组代谢性谷氨酸受体(Group II metabotropic glutamate receptors,m Glu Rs)在谷氨酸传递过程中扮演着重要的调控角色。目前外源性m Glu2/3受体激动药物在动物实验取得重要成果,但临床试验效果并未达到预期。有研究通过对暂时性大脑中动脉栓塞脑卒中大鼠模型中应用2-(磷酸甲基)戊二酸[2-(phosphonomethy1)·pentanedioic acid,2-PMPA],抑制脑中内源性m Glu R3激动肽N-乙酰天冬酰胺谷氨酸(Nacetylaspartylglutamate,NAAG)水解,发现谷氨酸的损伤后释放明显减少,提示NAAG具有神经保护作用。而迄今为止关于应用2-PMPA是否能预防全麻药物毒性反应、防治术后认知功能鲜有文献报道。本研究将分为两部分实验:第一部分利用氯胺酮制作青春期小鼠认知功能缺陷模型,并通过不同药物对小鼠m Glu2/3受体调控,探究m Glu2/3受体对氯胺酮引起小鼠神经递质变化与行为变化的关系;第二部分通过蛋白表达及形态学检测的手段,探讨治疗性应用2-PMPA对氯胺酮诱发的认知功能的潜在机制。方法选取健康雌性SPF级C57BL/6小鼠,6-8周龄,体重20±5g,将通过实验前学习记忆检测的小鼠随机分成6组:Control组(对照组,给予等量生理盐水)、Ketamine组(模型组,给予Ketamine 30mg/kg,每30mins重复给药1次,每天三次)、MK801组(阳性对照组,给予MK801 1mg/kg)、LY354740组(干预激动组,首次给予Ketamine前30mins注射LY354740 10mg/kg,每天一次)、LY341495组(干预拮抗组,首次给予Ketamine前30min注射LY341495 0.5mg/kg,每天一次)和2-PMPA组(药物治疗组,每次给予Ketamine后5mins注射2-PMPA 50mg/kg,共三次),给药均为腹腔注射,持续14天。(1)第一天给药末次结束后10mins从各组小鼠中取5只行颈椎脱臼处死后快速取新鲜海马组织行谷氨酸检测以评价急性用药对小鼠海马递质浓度影响(各组n=5);(2)最后一天末次给药结束后24小时各组取5只小鼠快速取新鲜海马组织行谷氨酸、GABA检测以评价慢性用药对小鼠海马递质浓度影响(各组n=5);(3)各组小鼠依次进行旷场实验(OFT)、高架十字迷宫实验(EPMT)及水迷宫实验(WMT)等行为学检测,以评价各组小鼠情绪、学习记忆功能的变化(对照组n=12,模型组n=14,干预激动组n=10,干预拮抗组n=10,治疗组n=12,阳性对照组n=10);(4)从Control、Ketamine及2-PMPA组中各取5只小鼠制作石蜡切片,通过DAB染色,利用光学显微镜观察海马GAD67、GFAP阳性细胞表达情况(各组n=5);(5)从Control、Ketamine及2-PMPA组中各3只小鼠,通过Western blot检测海马EAAT2、GAD67、v Glu T1及x CT蛋白表达情况(各组n=3)。结果(1)第一天注射结束10mins后,与对照组(C组)相比,氯胺酮组(K组)、MK801组(M组)及拮抗干预组(LY341495组,LY34组)海马组织中谷氨酸含量明显升高(P<0.01)。与K组相比,PM组和LY35谷氨酸含量明显降低(P<0.01);而LY34组海马组织中谷氨酸含量明显升高(P<0.05)。(2)末次注射结束24h后,与C组相比,K组及LY34组海马组织中谷氨酸含量明显升高(P<0.05);PM组、LY35组及M组海马组织中谷氨酸含量变化均无统计学差异(P>0.05);K组、LY34组及M组海马组织中GABA含量显著下降(P<0.05);PM组和LY35组海马组织中GABA含量变化均未见明显统计学差异(P>0.05);与K组相比,LY35海马组织中谷氨酸含量明显降低(P<0.05);PM组和LY35海马组织中GABA含量明显升高(P<0.05)。(3)OFT:与C组比较,M组小鼠在旷场中的总移动距离明显增多(P<0.05),余各组小鼠总移动距离变化未见明显统计学差异(P>0.05);与C组相比,K组及LY34组的中央区进入次数明显减少(P<0.05),M组中央区进入次数增加(P<0.05),余各组未见明显差异(P>0.05);与K组相比,LY35组进入中央区次数明显上升(P<0.05)。中央区活动时间:与C组相比,K组的中央区活动时间明显减少(P<0.05),余各组未见明显统计学差异(P>0.05)。与K组相比,PM组及LY35组排泄次数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。EPMT:与C组相比,各组总移动距离、各臂进入总频次、开闭臂进入频次比例均无显著差异(P>0.05);与K组相比,LY35组及M组进臂总频次明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。WMT:训练期最后一天(T0-5)到达平台的逃避潜伏期均无统计学差异(P>0.05);定位航向实验(T1-1~T1-4共4天)中,与C组相比较,K组、M组及LY34组逃避潜伏期明显延长(P>0.01);与K组比较PM组及LY35组逃避潜伏期均明显缩短(P<0.01);空间探索实验(T1-5)中,与C组相比,K组、M组及LY34组达原平台位置潜伏期显著延长(P>0.01);与K组相比,PM组达原平台位置潜伏期均显著地缩短(P<0.01),LY35组达原平台位置潜伏期明显缩短(P<0.05),LY34组达原平台位置潜伏期未见统计学差异(P>0.05);与C组相比,M组小鼠穿越原平台位置次数均显著减少(P>0.01),K组及LY34组穿越原平台位置次数均明显减少(均为P>0.05),余各组差异不具统计学意义(P>0.05)。(4)与C组相比较,K组海马区GAD67、GFAP阳性细胞数量显著性降低(P<0.01,P<0.05),PM组GAD67阳性细胞数量显著性降低(P<0.05);与K组相比,PM组海马区GAD67、GFAP阳性细胞数量有所升高(P<0.05)。(5)与C组相比,K组海马区x CT、v Glu T1表达量明显上调,EAAT2、GAD67表达量明显下调,PM组海马区各蛋白表达量没有明显变化趋势。结论(1)氯胺酮急性及慢性暴露均能诱发青春期小鼠海马区域谷氨酸浓度上升,而慢性暴露可引起谷氨酸/GABA比例失调,造成兴奋/抑制失衡,导致小鼠表现情绪障碍、空间学习记忆能力受损;(2)II组代谢性谷氨酸受体参与谷氨酸信号通路,其激动后可减少谷氨酸释放,逆转兴奋/抑制失衡,改善氯胺酮诱发的情绪障碍及空间学习记忆能力受损;(3)慢性氯胺酮暴露可诱发C57小鼠海马内GAD67阳性细胞表达减少,降低GAD67表达量而影响GABA合成,导致或加重兴奋/抑制失衡,表现出认知功能障碍的症状。2-PMPA可抑制谷氨酸过度释放,减少兴奋性毒性,逆转兴奋/抑制失衡,改善认知功能;(4)慢性氯胺酮暴露诱发海马区细胞外高谷氨酸状态,可能与星形胶质细胞表达减少、EAAT2表达下降及谷氨酸/胱氨酸反向转运体表达上调有关,并刺激v Glu T1代偿性表达上调。使用2-PMPA可防止谷氨酸摄取系统结构及功能紊乱,维持谷氨酸稳态。