论文部分内容阅读
随着分子生物学和生物医学的快速发展以及生物分析技术的不断提高,单个细胞内不同细胞器区域的生理活动逐渐发展成为研究热点。单个细胞内各种小分子亚细胞区域分布和浓度情况对维持细胞的正常形态及生理活动至关重要,特别是细胞内pH和钙离子的分布与许多生命活动,如细胞增殖、离子运输、胞吞作用、肌肉收缩等息息相关。因此在亚细胞水平对重要信号分子的实时、动态监测,对生命科学和生物医学研究具有重要的意义。荧光分析技术以其灵敏度高,选择性好,分析特征参数多,操作简便等优点在生物检测和生物成像领域备受瞩目。目前,荧光分析技术主要依靠种类丰富、技术成熟的有机小分子荧光探针,但是有机小分子荧光探针往往合成过程复杂、抗光漂白能力差、后期靶向修饰困难等缺点,限制了其在生物检测领域的深入应用。近年来,随着纳米技术的快速发展,荧光纳米探针以其合成简单、光学性质可调、便于后期修饰等优点引起人们的广泛关注。相比于传统有机小分子荧光探针,荧光纳米探针通常亮度更高、光稳定性更好。另外,随着现在纳米制备技术的提高,对纳米粒子尺度的精确控制及对其功能化手段的不断完善,很大程度上使荧光纳米探针满足了生物检测和亚细胞区域生物成像等领域的要求。因此,本论文基于DNA纳米机器和二氧化硅纳米微胶囊,设计合成了多种荧光纳米探针,并应用于亚细胞区域pH及Ca2+浓度和时空分布的实时、动态监测,分别开展了以下几方面的工作:(1)pH敏感DNA纳米机器的设计合成及分析应用。基于DNA duplex-triplex转换,设计合成了一种pH敏感的比率型DNA荧光纳米机器t-switch。在pH=5.3-6.0范围内,t-switch的荧光信号与pH值有良好的线性响应关系;并且在pH循环下,t-switch的打开和关闭响应迅速,瞬时完成,经过多次循环仍保持稳定的性能;更重要的是,与已报道的大多数DNA纳米机器不同,t-switch不需要转染试剂辅助即可在15分钟内被细胞摄取,为细胞内pH梯度变化的实时动态监测奠定了基础。(2)溶酶体靶向的pH敏感PEI/DNA complexes复合纳米机器的设计合成及分析应用。利用PEI与t-switch的静电作用,设计合成了靶向溶酶体的PEI/DNA complexes。该复合纳米机器具有t-switch相似的pH敏感性能,而工作范围扩展到pH=4.6-7.8。研究发现,该复合纳米机器可通过细胞胞吞途径进入细胞溶酶体中,并保护DNA骨架免受DNA酶的破坏。在细胞成像实验中成功实现了对溶酶体不同生理阶段中pH变化的实时、动态监测。(3)线粒体靶向Ca2+荧光纳米探针的设计合成及分析应用。本文采用反相微乳液法将Ca2+荧光探针Fluo-4包裹入氨基化二氧化硅纳米微胶囊,制备成Ca2+荧光纳米探针,并在其表面修饰具有线粒体靶向定位功能的信号肽,使其成功定位于线粒体内,得到了能够靶向线粒体的Ca2+荧光纳米探针,为线粒体内Ca2+浓度变化的实时监测奠定了基础。(4)线粒体靶向和内质网靶向双波长比率Ca2+荧光纳米探针的设计合成及线粒体、内质网Ca2+浓度变化的同步监测。利用反相微乳液法将低亲和力,工作范围在mmol水平的钙离子探针STDBT包入二氧化硅纳米微胶囊,通过表面信号肽修饰和引入对Ca2+不响应的惰性染料参比,设计合成了线粒体Ca2+荧光纳米探针(CFNP-M)和内质网双波长比率Ca2+荧光纳米探针(CFNP-E),实现了对线粒体和内质网内Ca2+浓度瞬变的同步、实时、动态监测,为探索Ca2+在调节细胞功能中的作用机制提供了新方法。