近年来抗生素耐药问题已经成为全球关注和研究的热点。理解耐药基因的分布规律、富集情况和传播途径,是控制和解决抗生素耐药问题的重要前提。随着“One Health”理念的提出,人们对耐药基因的研究已经不再局限于单一介质上的分布与传播,而是更加关注耐药基因在跨介质甚至跨物种之间的传播,如在“环境-动物-人体”之间的传播。土壤-植物系统是连接自然生态环境、动物与人类健康的重要枢纽。了解耐药基因在土壤-植物系统中的传播扩散规律,是有效控制耐药基因在“环境-动物-人体”之间传播的基础。虽然目前关于土壤耐药基因的研究很多,但对于耐药细菌或耐药基因传播进入土壤后,对土壤土著微生物的影响还没有引起足够的关注。此外,尽管植物微生物耐药基因近年来已成为新的研究热点,但目前研究多集中于分布规律,对植物微生物耐药基因的来源、传播路径等还不十分清楚。因此,本课题聚焦于土壤-植物系统,分别以土壤介质、土壤-植物跨介质、植物介质为落脚点,补充完善耐药细菌传播扩散到土壤后对土壤土著菌群的影响;诠释耐药细菌及其耐药基因在土壤-植物系统中跨介质传播扩散过程;解析植物微生物耐药基因的主要来源和传播路径。所获结果将为理解耐药细菌及其耐药基因在土壤-植物系统中的传播扩散提供思路,为控制抗生素耐药性在环境中的传播提供重要理论依据。按照外源耐药细菌和耐药基因进入土壤-植物系统后可能的传播过程,本研究首先聚焦外源耐药细菌引入土壤后对的丰度变化,并且全面评价了其对土壤土著细菌结构和功能的影响,以及土壤中的抗生素污染程度对这些影响的作用。为此,我们进行了土壤微宇宙实验,选择了10和500 mg/kg两种浓度的四环素来模拟土壤中抗生素污染相对真实和极端的情况。考虑到耐药大肠杆菌在畜禽粪便和污泥中的广泛存在,所以选择了多重耐药的大肠杆菌作为耐药细菌模型的代表。通过分离培养计数的方法,定量分析了外源耐药细菌在进入土壤后的存活情况。通过16S高通量测序,解析了不同存活期的外源耐药大肠杆菌对土壤细菌群落组成的影响,并通过检测土壤细菌群落利用碳源类型的数目和分布情况,分析了其对土壤细菌群落功能的影响。结果表明,无论四环素污染是否存在,外源耐药细菌引入土壤后丰度都会发生显著降低,但仍能存活达76天之久。研究结果表明外源耐药细菌引起了土壤细菌群落多样性和生态位宽度的增加,同时土壤细菌群落的组成和生态位结构也都发生了改变。四环素污染可能通过促进外源耐药细菌在土壤中的存活丰度加剧这些影响。有趣的是,外源耐药细菌诱发的细菌群落组成和功能的变化是同步的,这可能是由一些核心类群丰度的显著变化所驱动的。此外,在无四环素污染和低污染的土壤中,外源耐药细菌对土壤细菌群落影响的持续时间比其存活时间要更久,表明外源耐药细菌可能在一个相对较长的时期内,都会对土壤细菌群落的稳定性造成挑战。外源耐药细菌进入土壤后,仍可存活一段时间甚至最终定殖土壤菌群,所以耐药基因可能进一步传播至土壤生长的植物中。然而,这一传播的具体过程及影响因素目前还不清楚。对此,本研究进一步构建了植物水培系统,使用双荧光标记并携带RP4耐药质粒的大肠杆菌作为模式耐药细菌,示踪其从外部生长环境（即水培溶液）向拟南芥内部的传播过程。为了探究土壤细菌对此过程的影响,本研究还设置了添加土壤细菌的实验组和未添加土壤细菌的对照组。使用荧光定量PCR结合激光共聚焦荧光显微镜直观地表征了外源耐药细菌及其耐药基因在水培溶液和植物内外部的分布与传播情况。同时,结合流式细胞分选技术和16S r RNA高通量测序,解析了水培系统中通过水平转移获得耐药基因的土壤细菌和植物内生菌的组成结构。结果显示,外源性多重耐药大肠杆菌可以从植物生长的水溶液环境迁移到植物内部,并通过水平转移将其携带的RP4耐药质粒传播到植物内生细菌中。土壤细菌的存在可抑制外源多重耐药大肠杆菌在植物内部定殖,但令人意外的是,却促进了其携带的RP4耐药质粒向植物内生菌传播。在土壤细菌存在的情况下,植物中携带RP4耐药质粒的细菌群落结构发生了显著改变,并且植物内部和外部核心共有的获得RP4耐药质粒的细菌数量也增加了。这些结果说明土壤细菌,特别是其中的变形菌,可能先从多重耐药的大肠杆菌中获得RP4耐药质粒,然后迁移到植物组织中,进而促进了RP4耐药质粒在植物内生菌中的传播。值得注意的是,外源性多重耐药大肠杆菌可能将携带的耐药基因通过水平转移传播到植物内生的人类和植物致病菌,暗示潜在的生态和健康风险。外部生长环境中的耐药细菌可以迁移到植物内部,并将其携带的耐药基因水平传播到植物内生菌,所以外部环境的耐药基因可能是植物微生物耐药基因的部分来源。但是,目前关于植物微生物耐药基因的来源分布、相对贡献和传播路径的研究少之又少。因此,本研究在最后还进一步解析了植物微生物耐药基因的主要外部环境来源及其传播路径。为此,我们采集了生菜及其生长环境中的有机肥、空气、土壤和灌溉水,并进行了宏基因组测序和数据分析。与耐药基因数据库SARG比对进行耐药基因的注释,确定了耐药基因在生菜不同部位以及有机肥、空气、土壤和灌溉水中的分布特征。结合metaphlan2分析生菜不同部位以及有机肥、空气、土壤和灌溉水中的细菌群落结构。结合普式分析分别探究环境和植物中耐药基因的水平转移潜力。利用FEAST分析,解析植物不同部位中耐药基因和微生物的主要来源。最后,用MEGAHIT（v 1.2.9）对宏基因组序列进行组装,用Prodigal（v 2.6.3）预测宏基因组序列中的ORF,Diamond、SARG和ICEberg数据库对contigs上的耐药基因和MGE进行注释,最后进行种水平上的分类注释,以确定具有水平转移能力的耐药基因的宿主。结果显示,生菜叶表面检测到的耐药基因数目最多,多重耐药基因是生菜微生物耐药基因（无论根、叶）中丰度和数目最高的耐药基因类型。灌溉水和土壤是生菜微生物耐药基因的主要外部环境来源,灌溉水主要通过叶际介导的从上到下的路径传播耐药基因,土壤主要通过根际介导的从下往上的路径传播耐药基因。生菜微生物耐药基因的来源分布与其微生物的来源分布并不一致,这可能是因为生菜内部（特别是叶）的耐药基因具有高水平转移潜力。假单胞菌是生菜中负载具有水平转移能力的耐药基因的主要宿主。以上结果揭示了植物微生物耐药基因的主要外部环境来源和传播路径,可以为控制植物微生物耐药基因的传播扩散提供一定的理论依据。