脑缺血再灌注模型建立及PCA神经保护研究

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脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)是指大脑缺血一段时间后恢复供血,大脑受到更严重损伤的现象。CIRI会严重影响人类生命健康水平,主要表现为大脑的结构损伤、代谢障碍以及功能障碍等。目前作为重要新药研发工具的体外细胞培养模型和动物模型培养周期长、成本高,需要重复多次筛选才有可能进入临床阶段最终走向市场,这使得新药研发效率很低且失败风险大大增加。微流控技术(Microfluidic technology)作为一种新兴技术,具有可以控制液体流动速度和方向,消耗的试剂样品少,大幅度提高分析效率的优点,因此有希望成为新药研发及药物评价的重要实验平台。本论文首先基于微流控技术设计加工了一种CIRI病理模型芯片还原了血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)及受CIRI损伤严重的额叶颞叶区域,两层芯片均采用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)加工制成,顶层和底层分别为由聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethylmethacrylate,PMMA)制成的夹板来对芯片进行固定支撑。两层芯片上分别设计有半径为8mm的培养孔,培养孔与夹在芯片之间的聚四氟乙烯(Poly tetra fluoroethylene,PTFE)膜相互作用作为细胞生长发育的空间环境,芯片还设计有用于细胞接种及培养液的流入流出孔道。对设计加工的芯片进行流体力学仿真模拟,培养液流速在0.956-6.22m/min区间时,培养液到达处神经细胞(Nerve cells,NCs)的剪切力满足人脑颅内0.3-2KPa的真实剪切力情况;对二氧化碳在芯片内扩散情况进行仿真模拟,将芯片置于环境500s后芯片内的气体环境即与外界环境一致,为后续芯片内的细胞培养提供理论依据。接着本论文完成了对NCs的培养与选取:提取新生24h大鼠的NCs后进行原代培养及纯化,将纯化3天后的NCs进行免疫荧光鉴定,表达其特异性标志物(β-TubulinⅢ);传代培养PC12细胞,对细胞生长曲线进行测定,选取5×104Cells/m L的细胞密度接种。比较后选取PC12细胞作为NCs接种到微流控芯片内,通入低糖培养液置于低氧箱完成了NCs氧糖剥夺的模拟进行模拟缺血过程,再将接种细胞的芯片从低氧箱转移至CO2培养箱同时换用高糖培养基完成复糖复氧的模拟进而实现对CIRI的模拟,通过加入不同浓度的原儿茶酸(Protocatechuic acid,PCA)在芯片体系内考察PCA(0、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)对CIRI的神经保护作用。实验结果表明,设计加工的CIRI微流控芯片能够在24h内较好的维持NCs的生长状态,CIRI会导致微流控芯片内的NCs增殖变缓,死细胞数量升高,活细胞数量降低,乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的漏出量增加,TNF-α、Notch1蛋白表达含量增加,Bcl-2蛋白表达含量降低;PCA对NCs的神经保护作用呈现出浓度依赖性:随着PCA浓度的增加,NCs受CIRI影响逐渐减小,较CIRI组相比,一定程度地使NCs增殖变快,死细胞数量减少,活细胞数量增多,LDH漏出量减少,TNF-α、Notch1蛋白表达含量降低,Bcl-2蛋白表达含量升高。综上所述,本文设计加工了CIRI微流控芯片,将选取的NCs接种到CIRI微流控芯片内,设置Control组、CIRI组、PCA1组、PCA10组、PCA100组五个对照组,在微流控芯片体系内探究了PCA可以通过促进细胞增殖、降低死细胞数量、提高活细胞数量、减少乳酸脱氢酶漏出、降低TNF-α、Notch1蛋白表达含量、提高Bcl-2蛋白表达含量来对经CIRI的NCs起到神经保护作用,并呈现出浓度依赖性。
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