冠心病(coronary heart disease,CHD)是进入二十世纪以来,人类健康和生命的最大威胁。但是,其发病机制尚不明确,成为阻碍其治疗的重大障碍;针对其发病机制的研究,一直是心脏医学的热点。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的病理病变基础。在其发展过程中,经历脂纹、脂斑、纤维斑块、粥样硬化斑块等进展时期;通过对临床发病致死病例的尸体解剖,人们最初认识AS斑块,是终末期溃疡样的动脉内膜瘤样增生;进而在非冠心病死亡的年轻病例的动脉血管壁上检测到起始阶段脂纹和脂斑的存在;最后通过对AS实验动物和临床病理的进一步观察,人们得出AS具有缓慢和逐渐进展的特点。近年来临床观察发现,冠心病终末期具有加速进展的临床表现,表现为发病突然、风险度高等特点。如果救治不及时,死亡率和致残率明显升高。分析其病理改变发现以易损斑块为主要特征,斑块不稳定到破裂,发展迅速并引起瀑布样血栓形成,导致疾病的快速和剧烈进展。人们再次认识到冠心病终末期具有加速演变和剧烈进展的特点,将这一类加速进展阶段的末期情况归纳为急性冠脉综合症(acute coronary syndrome,ACS)。冠心病在发病和进展时期的隐蔽性大,而进入终末期的致死率和致残率明显升高,对人们生活和工作构成极大的损害。如何早期发现、早期防治以及有效的减少其发病率和致残率,是医学界的热点问题。为了更好的解决这些临床问题,对其的发病机制和进展期恶化因素的研究成为高度关注的核心。因为AS的病变过程漫长,而终末期又具有进展迅速的特点。人们发现其发病过程与创伤、肿瘤和炎症及自身免疫性疾病都具有一定的相似点,使得对AS的发病和进展机制有了种种不同的推测,类创伤、类肿瘤以及类炎症和自身免疫性疾病等等。然而,如果是创伤修复,为何越修复越进展;如果是肿瘤,为何越生长细胞调亡反而增多;如果是慢性炎症和自身免疫性疾病,又没有公认的明确的抗原来源。各种学说都在解释AS的发生发展过程中都遇到一定的困难。如何寻找突破口,最终阐明AS发病机制成为困扰各个学说的主要问题。近期,人们对ACS患者体内活化免疫细胞和细胞因子的检测以及对AS各个时期病变中活化免疫细胞检测中,发现冠心病终末期患者不仅仅在斑块病变局部可以检测到大量活化T淋巴细胞和单核细胞,其外周血中也可以检测到前炎症因子的高水平表达,提示在AS的终末阶段,出现全身炎症反应增强的表现,又根据活化T淋巴细胞的出现,使得人们对炎症和免疫参与疾病发展的关注逐渐升温。针对ACS患者外周血和病变组织中活化T淋巴细胞亚组、分型、受体及黏附因子等方面的研究都发现病变局部有大量活化T淋巴细胞存在,并出现亚组分型和蛋白表达各方面的差异。斑块内T淋巴细胞活化的根源在那里,使得人们自然注意到作为诱导T淋巴细胞活化的主要抗原呈递细胞——树突状细胞(dendritic cells,DCs)的存在。斑块内是否存在作为抗原提成的DCs;DCs的来源如何;DCs是否为成熟状态,其功能状况怎样;DCs是否吞噬抗原并将抗原肽刺激信号提呈给初始T淋巴细胞,而诱导T淋巴细胞增殖和活化等等问题,成为关注的热点。作为DCs的研究,因为DCs在体内各组织中存在细胞量少,在外周血中DCs占有核细胞的比例低于1%,在正常血管壁内DCs更难以检测,这些给DCs的研究带来一定的困难。部分学者通过培养外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)来源的DCs,在体外获得一定数量的DCs,并对来源于AS不同阶段患者的DCs成熟状态及免疫功能作比较,发现ACS患者PBMC来源的DCs高表达CD80、CD86和CD83等共刺激分子和黏附分子,表现为成熟状态,并且具有较强的活化T淋巴细胞的能力。提示ACS患者体内可能存在诱导DCs活化的物质,使得DCs表现为成熟阶段。而应用氧化低密度脂蛋白(oxidated lowdensity lipoprotein,oxLDL)、尼古丁和热休克蛋白(heat shock protein,HSP)等AS相关物质都能在体外诱导DCs成熟,并具有一定的免疫活性。但是,对于DCs的研究如果始终停留在对可能诱导AS的抗原刺激物对DC活化作用的检测,或者对ACS患者PBMC体外培养DCs成熟标准的检测,则对AS的形成和发展机制无进一步的深入。为了突破目前研究的局限性,进一步证实DCs确实参与了AS的进展,并在ACS患者不稳定斑块的形成中起到启动和活化T淋巴细胞,而使得炎症反应增强的作用。根据DCs在体内经历从骨髓干细胞发育成DCs前体细胞,到经过血液迁徙到抗原位点,未成熟细胞通过吞噬抗原,并提呈抗原成为成熟细胞,后再迁徙到淋巴结T细胞区激活初始T淋巴细胞增殖全过程的情况。我们设想虽然不能够直接检测患者AS病变局部的DCs分布和成熟状态,但是可以通过分析外周血DCs分布情况从侧面反应其迁徙到血管壁内的状况。如果ACS患者斑块内DCs聚集和活化,吞噬可能存在的抗原物质而活化,其血管壁内的DCs分布必然会上升,这样会引起其血液中DCs和淋巴内DCs之间的重新分布。因此,本实验研究从DCs外周血比例和数量检测出发,以期在DCs发生和发育过程中检测其不同时期和不同组织中分布和比例不同,探讨DCs在易损斑块形成过程中的作用,为冠心病免疫发病机制的阐明奠定一定实验基础。本实验分为三个部分,分别入选临床上冠脉造影正常的对照组、具有胸痛症状而造影正常的胸痛综合症患者组、稳定性心绞痛组和急性冠脉综合症组,共81例患者。通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析不同病人外周血IL-6和hs-CRP水平,通过流式细胞检测技术检测外周血mDC和pDC亚群分布。接着应用免疫组织化学和流式细胞检测技术检测了糖尿病大鼠和糖尿病+高脂饮食大鼠等AS模型外周血、脾脏及主动脉内DCs和T淋巴细胞的分布情况,应用体外培养大鼠骨髓源性的DCs,并通过荧光CFSE标记后回输回大鼠尾静脉,应用流式细胞检测和荧光显微镜观察标记DCs在外周血和主动脉内的分布变化。最后,通过AS相关抗原体外刺激大鼠骨髓源的DCs,应用ELISA法观察培养上清趋化因子MIP-1α和MCP-1水平,应用荧光定量PCR方法检测DCs趋化因子受体表达情况。结果分述如下:1.ACS患者外周血mDC亚群比例及绝对数量减少1.1各组患者一般临床资料情况比较无显著性差异临床入选病例总共81例,其中AMI组20例、UAP组20例、SAP组20例、CPS组11例、对照组10例。一般临床资料的比较显示:各组的年龄、性别比例相比无显著性差异(P＞0.05)。各组中主要的心血管病危险因素,如:吸烟(Smoking)、高血压(Hypertension)、糖尿病(Diabetes mellitus)、总胆固醇(Totalcholesterol)、甘油三脂(Triglyceride)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL cholesterol)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL cholesterol)等,相互之间的比较均无显著性差异(P＞0.05);1.2各组患者外周血树突状细胞亚群比例及数量情况外周血mDC和pDC亚群分别根据细胞膜表达的CD11C和CD123阳性,而其他PBMC表面标志物阴性的细胞群。正常对照组、CPS组、SAP组、UAP组和AMI组外周血mDC占PBMC比例分别为:12.03±3.9‰、12.3±3.3‰、10.96±6.4‰、4.74±2.63‰和4.97±2.7‰;而外周血mDC实际数量分别为:84.4±37.3/ul、81.2±34.8/ul、73.2±42.2/ul、41.0±28.3/ul和45.8±25.2/ul。比较外周血mDC占PBMC比例和mDC实际数量在五组间差异有显著性意义(P＜0.001)。LSD比较分析表明,UAP组和AMI组比正常对照组、CPS组和SAP组mDC占PBMC比例和mDC实际数量水平升高(均P＜0.001);但是,外周血pDC亚群占PBMC比例和实际数量各组之间比较差异没有显著性意义;1.3各组患者血浆hsCRP和IL-6水平检测情况应用ELISA方法检测各组患者外周血前炎症因子hsCRP和IL-6水平,发现正常对照组、CPS组、SAP组、UAP组和AMI组血浆检测hsCRP水平分别为2.1±0.40,2.2±0.39,2.24±0.43,5.954±1.22和22.2±5.72ng/ml。IL-6水平分别4.47±1.02,4.5±0.94,4.74±0.98,6.17±1.27和20.1±4.75 pg/ml。血浆hsCRP和IL-6水平在五组间差异有显著性意义(P＜0.001)。LSD比较分析表明,UAP组和AMI组比正常对照组、CPS组和SAP组血浆hsCRP和IL-6水平升高(均P＜0.001);说明急性冠脉综合症患者较正常人,胸痛发作但冠脉正常以及稳定型心绞痛患者血浆前炎症因子hsCRP和IL-6水平升高,急性冠脉综合症患者体内存在着炎症反应和免疫活化;1.4AMI患者住院当天和术后1周外周血DCs亚群比例及数量情况和血浆hsCRP和IL-6水平检测情况针对AMI组患者入院当天外周血DCs亚群比例及数量和血浆hsCRP和IL-6水平检测都明显升高的情况下,我们对AMI患者术后1周部分患者复查外周血DCs亚群比例及数量和血浆hsCRP和IL-6水平检测,发现1周后AMI患者外周血mDC和pDC占PBMC比例分别为9.24±2.64‰、1.33±0.32‰,外周血mDC比例升高较手术前差异有显著性意义(P＜0.05);而血浆hsCRP和IL-6的水平也下降,分别为14.37±2.50ng/ml和15.83±3.02pg/ml(P＜0.05)。AMI患者经治疗1周后,外周血mDC亚群比例和数量与血浆前炎症因子都有明显下降,说明mDC亚群比例与炎症因子的变化高度相关;1.5PCI术前和术后即可外周血DCs亚群比例及数量情况和血浆hsCRP和IL-6水平检测情况PCI手术对病变局部有一定的损伤作用,为了除外手术对血浆炎症因子和外周血DCs亚群的影响,我们对PCI部分手术患者术后12小时外周血DCs亚群比例及数量和血浆hsCRP和IL-6水平进行检测。手术患者术前外周血mDC和pDC占PBMC比例分别为(0.38%-2.47%)和(0.12-0.34%),血浆hsCRP和IL-6的浓度分别为(1.8-29.2ng/ml)和(4-25 pg/ml);术后12小时外周血mDC和pDC占PBMC比例分别为(0.38%-1.49%)和(0.11-0.21%),血浆hsCRP和IL-6的浓度分别为(1.5-30.6ng/ml)和(3.4-23.8pg/ml),与术前相比外周血DCs比例和血浆hsCRP和IL-6的水平变化无明显差异(p＞0.05),见图1-4。术前与术后12小时,外周血DCs亚群比例及数量情况和血浆hsCRP和IL-6水平无明显差异,说明手术对炎症因子和DCs的亚群分布无明显影响。2.糖尿病大鼠同样可以检测到外周血DCs分布减少,标记DCs示踪结果提示DCs加速向主动脉壁迁徙2.1糖尿病大鼠成模情况及各组大鼠一般情况的比较STZ腹腔注射后3天,20只大鼠血糖均超过16.7mmol/L,糖尿病大鼠模型制膜成功率100%。STZ腹腔注射后2月,对照组和糖尿病组大鼠体重比较有所升高,但是差异没有统计学差异,实验结束时的血糖在糖尿病组较对照组明显升高,而血胆固醇在三组之间明显差异,LSD法比较发现高脂饮食组较糖尿病和对照组明显升高(P＜0.001);血甘油三脂在三组之间也存在明显差异,LSD法比较发现高脂饮食组较糖尿病和对照组明显升高(P＜0.001),糖尿病组较对照组轻度升高(P＜0.01);2.2各组大鼠主动脉内膜增生情况比较:比较喂养4周两大鼠主动脉形态学,糖尿病组光镜下见中膜和内膜均明显增厚,有较多增生的血管平滑肌细胞,呈环形排列整齐,新生内膜中有大量细胞外基质形成,管腔明显狭窄。各种参数包括管腔面积、内弹力膜环绕总面积、新生内膜面积及内膜增生百分比的结果比较,管腔面积、新生内膜面积和内膜增生百分比三组之间差异有显著性意义,LSD法比较发现高脂饮食组和糖尿病与对照组相比,管腔面积减小(P＜0.001),新生内膜面积增大(P＜0.05)及内膜增生百分比增大(P＜0.001)。说明糖尿病大鼠主动脉内膜较对照组新生内膜增生;2.3三组大鼠外周血、脾脏及主动脉内DCs占总细胞比例情况的比较大鼠DCs检测分别根据细胞膜表达的OX-62和MHCⅡ标志物阳性的细胞群。在我们的流式细胞结果分析,脾脏DCs分布比例在对照组、糖尿病组和糖尿病合并高脂饮食组分别为1.74±0.66%、1.80±0.25%和1.86±0.31%,各组之间差异无显著性意义;外周血中DCs的分布比例在对照组、糖尿病组和糖尿病合并高脂饮食组分别为1.18±0.79%、0.31±0.17%和0.32±0.19%。三组之间差异有显著性意义(P＜0.01),LSD法比较发现高脂饮食组和糖尿病较对照组下降;主动脉内DCs比例在对照组、糖尿病组和糖尿病合并高脂饮食组分别为0.44±0.24%、1.66±0.24%和1.57±0.32%,三组之间差异有显著性意义(P＜0.001),LSD法比较发现高脂饮食组和糖尿病较对照组升高。;2.4用CFSE荧光标记DCs示踪,1—7天外周血荧光标记DCs示踪情况。经静脉弹丸式注射1.5～2×10~7/ml约0.5ml,注射后即可、1天、3天、5天和7天分别从鼠尾静脉采血应用流式细胞仪检测外周血内荧光标记细胞分布比例情况,正常组分别为11.73±1.68%、5.53±1.24%、6.9±1.21%、3.92±0.52%和1.32±0.6%;糖尿病大鼠组分别为10.59±2.82%、4.34±0.9%、3.74±0.79%、1.94±0.58%和0.67±0.15%;糖尿病合并高脂饮食大鼠组分别为10.9±2.65%、3.99±1.07%、3.03±0.5%、1.74±0.28%和0.43±0.24%,糖尿病组和糖尿病合并高脂饮食组在注射1天后外周血荧光标记细胞比例较对照组明显下降(P＜0.001);2.5主动脉内荧光标记情况示踪标记第七天,处死大鼠,分离主动脉细胞,流式细胞检测荧光标记细胞分布比例在正常组、糖尿病组和糖尿病合并高脂饮食组分别为0.73±0.49%、2.01±0.32%和1.59±0.52%。三组之间明显差异,LSD法显示高脂饮食组和糖尿病组主动脉内标记DCs比例较对照组明显升高(P＜0.01)。3.oxLDL可以刺激骨髓源DCs分泌MCP-1,并高表达CCR-7受体3.1 oxLDL与骨髓源DCs共培养,趋化因子MIP-1α和MCP-1水平:应用ELISA方法检测,不同时间段培养上清中MIP-1α和MCP-1水平;上清液中MCP-1随时间和oxLDL浓度升高而逐渐升高,较对照组有明显差异(P＜0.01)。而MIP1γ水平较对照组升高无显著性差异。3.2荧光定量PCR显示培养细胞中CCR5和CCR7趋化因子受体表达应用荧光定量PCR检测CCR5与CCR7基因表达情况也同样发现,CCR5基因表达较对照组无明显变化,但是CCR7基因表达则明显升高。通过上述三个部分的实验,我们能够得出以下结论:①ACS患者外周血mDCs亚群比例及绝对数量发生变化,ACS患者体DCs处于活化状态;②ACS患者外周血IL-6和hs-CRP细胞因子分泌增多,ACS患者处于炎症激活状态;③ACS患者外周血中mDCs细胞亚群比例随血浆IL-6和hs-CRP细胞因子水平变化而变化,mDCs亚群比例变化与炎症高度相关,可能与斑块不稳定有关;④糖尿病大鼠和糖尿病合并高脂饮食大鼠的外周血DCs分布同样下降,且在其主动脉内观察到DCs比例上升,糖尿病大鼠外周血DCs可能加速迁徙入动脉壁;⑤体外标记培养骨髓源DCs,回输后示踪发现,标记DCs在外周血中比例随时间显著下降,并在糖尿病组主动脉壁内观察到标记DCs比例上升,说明DCs加速迁徙入主动脉壁与AS的发生有关;⑥oxLDL与骨髓源DCs共培养,培养上清液中MCP-1随时间和oxLDL浓度升高而逐渐升高,而CCR7受体的表达明显较空白对照组升高,oxLDL可以刺激DCs成熟并表达成熟的趋化因子受体。