研究背景：白纹伊蚊又称亚洲虎蚊,是基孔肯雅病毒、登革病毒、寨卡病毒和黄热病毒的重要传播媒介。白纹伊蚊是一种入侵新栖息地能力非凡的物种,并且适应气候能力及在小环境中寻找庇护所的能力极强,促使它逐渐成为引起登革热暴发的主要媒介。近年来,白纹伊蚊已经成为引起欧洲、印度洋岛、非洲中部、夏威夷和中国南部登革热暴发的主要甚至唯一的媒介蚊虫。在我国每年也因为蚊虫的叮咬而发生多种疾病,蚊媒传染病仍然是威胁人们健康的因素。尤其2014年,我国登革热空前暴发流行,报道感染病例数超过4万例。然而,目前控制登革热流行的最有效的方法依然是使用杀虫剂控制媒介蚊虫的种群密度和数量。但是化学杀虫剂不仅容易造成环境污染,且随着杀虫剂的大量广泛应用白纹伊蚊对杀虫剂的抗药性日益明显。因此,寻找新的方法控制登革病毒的传播尤为重要。白纹伊蚊在叮咬人类吸血的同时传播登革病毒,而其嗅觉功能帮助白纹伊蚊寻找吸血宿主,这一传播过程为打破登革热的传播提供了新的思路。深入研究蚊虫的嗅觉系统,有利于我们了解蚊虫的生活习性,同时也有利于我们寻找新的防治调控手段来干扰蚊虫的嗅觉行为,探索打破登革热传播的新途径。蚊虫对周围环境的识别,主要依赖于自身的感官系统,尤其依赖于嗅觉系统。嗅觉系统在蚊虫交配、吸血、寻找产卵等重要生命活动中发挥着举足轻重的作用。昆虫的嗅觉系统主要包括嗅觉受体(odorant receptors, ORs)、嗅觉结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)以及相关的嗅觉神经元(olfactory receptor neuron)。分布在昆虫的嗅觉神经元上的嗅觉受体分为两种不同类型：一种共表达受体(odorant receptor co-receptor)简称Orco或者OR7,另外一种是传统的配体型嗅觉受体(odorant receptors, ORx)。Orco在幼虫和成虫这两个不同发育阶段皆有表达,且其氨基酸序列在昆虫的不同物种间具有高度的保守性。Orco基因的高度保守性和广泛表达也提示了Orco可能是嗅觉功能的重要组成元件。与之不同的是传统嗅觉受体的时空表达谱和功能具有高度的差异和种属特异性,因此研究者推测传统嗅觉受体的高度差异性与其参与介导具体的嗅觉行为密切相关。研究报道称Orco可能具有多重功能,其一是可以与传统的嗅觉受体结合形成异源复合物(ORX+Orco)。例如,冈比亚按蚊的Orco基因(An. gambiae Orco),与黑腹果蝇的Orco基因(DOR83b)一样,都可以与传统的嗅觉受体一起表达在异源表达系统人胚胎肾细胞(Human embryonic kidney 293 cells,HEK293)上,并且能够使传统嗅觉受体对气味刺激的反应增强。另外,Orco还可以形成同源复合物,该复合物具有离子通道的功能。而传统的嗅觉受体对气味的识别差异很大,大部分可以识别不同类型的气味,称之为broadly tuned odorant receptors;某些仅特异的识别一种或者一类气味,被称为narrowly tuned odorant receptors,例如,冈比亚按蚊的AgOR2特异性识别indole, AgOR8特异性识别1-octen-3-ol, AgOR5特异性识别2,3-butanedione。这些发现与组织特异性表达谱提出了一个假设,是否不同嗅觉受体在不同蚊虫上的表达与蚊虫的嗅觉行为(寻找吸血宿主和宿主偏好性)相关。例如,AgORl特异性的表达在雌性冈比亚按蚊上具有寻找吸血宿主的功能。AeOR4特异性的表达在埃及伊蚊上能够识别人类宿主的气味。然而,登革热的重要传播媒介白纹伊蚊的嗅觉受体的识别和功能知之甚少,目前只有AalOR2报道称可以特异性识别人类汗液的挥发物吲哚(indole)。因此,白纹伊蚊的嗅觉受体基因及其功能亟待研究。研究目的：本课题拟根据白纹伊蚊基因组数据通过生物信息学技术预测嗅觉受体基因。探讨在雌蚊嗅觉器官(触角)中大量表达的嗅觉受体在气味分子识别行为中所起到的作用。利用异源表达系统,HEK293细胞和转基因果蝇技术研究在白纹伊蚊雌蚊触角中大量表达的嗅觉受体基因,AalOR7 (Orco), AalOR10和AalOR88。我们在异源表达系统中分别单独和共表达嗅觉受体来探索他们对于气味刺激的单独识别作用及相互作用。此外,我们通过RNA干扰减少嗅觉受体在白纹伊蚊雌蚊中的表达量,继而研究RNA干扰后蚊虫的行为实验来进一步探索吸血宿主搜寻和宿主偏好性是否与特定的嗅觉受体相关。通过EAG的方法检测RNAi前后白纹伊蚊对不同化合物的识别能力。研究方法：1.以埃及伊蚊AaORs的氨基酸序列为模板,利用NCBI Blast对白纹伊蚊基因组数据进行同源比对分析,以获得白纹伊蚊嗅觉受体的预测氨基酸序列。并且根据埃及伊蚊AaORs和致倦库蚊CqORs命名白纹伊蚊AalORs。2.通过RT-PCR,分析白纹伊蚊AalORs组织特异性表达谱(幼虫、蛹、触角、喙、下颚须、足和躯干),分析AalORs是否具有组织表达特异性。3.通过RACE-PCR法,扩增白纹伊蚊嗅觉受体(AalOR7, AalOR10, AalOR88)的全长cDNA序列。4.利用软件MEGA 5.0对所获得的白纹伊蚊嗅觉受体进行系统进化树分析,分析它们与及埃及伊蚊、致倦库蚊、冈比亚按蚊嗅觉受体的亲缘关系。5.利用HMMTOP version 2.0和TMHMM server version 2.0软件预测白纹伊蚊嗅觉受体基因的跨膜结构域,并预测AalORs基因的功能。6.构建真核表达载体pME18s-AalOR7-eGFP, pME18s-AalOR10-DsRed和pME18s-AalOR88-DsRed,并进行PCR鉴定和测序分析。7.通过RT-PCR和western blot检验嗅觉受体在细胞中是否成功表达。HEK293细胞内钙成像实验(Calcium Imaging Assay):分析单独和共转染AalORs后HEK293细胞对于气味分子刺激的反应。8.利用φC31重组系统,将AalORx基因插入“空神经元”果蝇的UAS下游,构建UAS-AalORx品系。“空神经元”果蝇缺乏内在的嗅觉系统,对气味刺激没有电位反应。GAL4 driver (22a-GAL4)品系和UAS responder (UAS-AalORx)品系杂交筛选Fl (w/w/y; △halo/△halo; (UAS-ORx) /22a-Gal4)进行EAG实验。9.触角电位(Electroantennogram, EAG):用不同的气味分子刺激转基因果蝇的触角,记录触角电位,分析不同品系转基因果蝇触角对不同化合物的识别和反应能力。10.Y型管实验分析转基因果蝇对不同化合物的行为反应。11.通过胸腔注射靶标基因AalOR7,AalOR10和AalOR88的siRNA,进行RNA干扰(RNA interference, RNAi),并通过荧光定量PCR检测RNA干扰的效果。12.叮咬实验分析通过RNA干扰将靶标基因AalOR7, AalOR10和AalOR88基因沉默以后白纹伊蚊是否能搜寻到吸血宿主。13.宿主选择实验分析通过RNA干扰将靶标基因AalOR7,AalOR10和AalOR88基因沉默以后白纹伊蚊对于吸血宿主(人和小鼠)的偏好性是否改变。14.通过RNA干扰将靶标基因AalOR7, AalOR10和AalOR88基因沉默以后,通过EAG的方法检测RNA干扰前后白纹伊蚊对不同化合物的识别能力。研究结果：1.通过白纹伊蚊基因组数据,预测得到158个候选嗅觉受体基因,并根据埃及伊蚊和致倦库蚊的相似嗅觉受体序列为之命名。2.29个白纹伊蚊AalORs组织特异性表达谱结果显示同一种AalOR在不同的组织或者不同发育阶段的表达水平存在着差异,而不同的AalOR在同一组织或者同一发育阶段中的表达水平同样存在着显著的差异,说明AalORs的表达具有时空差异性。其中AalORs 7,10,14,45,59,88和105在雌蚊的嗅觉组织中特异性表达。3.成功获得了白纹伊蚊AalOR7, AalOR10, AalOR88基因的全长cDNA序列,包括5’和3’非编码基因序列。4.系统进化树分析可知白纹伊蚊与埃及伊蚊嗅觉受体的亲缘关系最近(白纹伊蚊与埃及伊蚊嗅觉受体的一致性为：AalOR7～99%、AalOR 10 96%和AalOR8881%)。并且AalOR7, AeOR7, AgOR7, CquiOR7, DOR83b属于co-receptor。 AalOR10和AalOR88属于传统的配体型嗅觉受体。5.利用HMMTOP version 2.0和TMHMM server version 2.0软件预测白纹伊蚊AalOR7和Aa1OR10基因属于7次跨膜蛋白,AalOR88基因属于6次跨膜蛋白。氨基酸序列分析,AalOR7拥有与其他物种Orco基因高度保守的ICL3, TMH6和TMH7结构域和钙调蛋白结合位点(calmodulin binding site, CaM) (329SAIKYWVER337)且其TMH6和ICL3可能是形成气味离子门控通道的结构域。AalOR10和AalOR88在序列结构上不含有钙调蛋白结合位点和气味离子门控通道。6.测序分析显示真核表达载体pME18s-AalOR7-eGFP, pME18s- AalOR10-DsRed和pME18s-AalOR88-DsRed构建成功。7.通过RT-PCR和细胞膜染料染色说明,白纹伊蚊嗅觉受体成功表达在HEK293细胞膜上。HEK293细胞内钙成像实验结果显示,单独转染AalOR7, AalOR10和AalOR88以及共转染AalOR10和AalOR88的HEK293细胞在气味刺激后与对照相比,细胞内钙离子浓度变化无统计学差异。共转染AalOR7和AalOR10的细胞受indole, 1-octen-3-ol,3-methyindole和DEET刺激后细胞内钙离子浓度与对照相比明显升高,差异显著,具有统计学意义(F=76.961,P<0.05)。共表达AalOR7和AalOR88的细胞受indole, 1-octen-3-ol,3-methyindole和DEET刺激后细胞内钙离子浓度与对照相比明显升高,差异显著,具有统计学意义(F=47.871,P<0.05)8.成功筛选出表达目的基因的转基因果蝇(w/w/y; △halo/△halo; (UAS-ORx)/22a-Gal4)。9.EAG结果显示,当转基因果蝇的触角上单独表达任何一种嗅觉受体时对于气味刺激均无明显的电位反应,当共表达AalOR7和AalOR10时,转基因果蝇触角对1-octen-3-ol有明显的电位反应,差异显著,具有统计学意义(F=28.254,P<0.05)。当转基因果蝇触角上共表达AalOR7和AalOR88时对indole和1-octen-3-ol有明显的电位反应,差异显著,具有统计学意义(F=8.281,P<0.05)。10.Y型管实验结果显示共表达AalOR7和AalOR10的转基因果蝇对1-octen-3-ol有明显的偏好性,差异显著,具有统计学意义(F=10.387,P<0.05),共表达AalOR7和AalOR88的转基因果蝇对于indole和1-octen-3-ol有明显偏好性,差异显著,具有统计学意义(F=14.807,P<0.05)。11.通过RNAi,与对照组注射无菌水的雌蚊相比,注射AalOR7-siRNA, AalOR10-siRNA和AalOR88-siRNA的蚊虫成功将靶标基因的表达水平降低,差异显著,具有统计学意义(AalOR7-siRNA-treated mosquitoes:t=13.191, P<0.05; AalOR10-siRNA-treated mosquitoes:t=2.490, P<0.05 AalOR88-siRNA-treated mosquitoes:t=18.275, P< 0.05).注射GFP-siRNA的蚊虫,与对照组相比,目的基因的表达量无统计学差异。12.通过RNAi降低靶标基因的表达水平后,叮咬实验(寻找吸血宿主实验)显示,与对照组相比较,AalOR7-siRNA实验组的吸血率显著下降,具有统计学意义(F=32.183,P<0.05)。AalOR10-siRNA和AalOR88-siRNA干扰后的雌蚊,与对照组相比较,吸血率无明显变化。13.宿主偏好性实验显示进行AalOR7-siRNA显微注射降低进行AalOR7的表达量后,雌蚊展现出了对人类宿主较低的偏好性,差异具有统计学差异(F=9.738,P<0.05)。14.蚊虫触角电位结果显示AalOR7-siRNA干扰后白纹伊蚊雌蚊触角对不同气味刺激与对照相比无明显电位反应,统计学无明显差异。注射water后的蚊虫触角对不同气味刺激与对照相比明显电位反应。结论：1.首次预测了158个白纹伊蚊嗅觉受体基因,并克隆鉴定了AalOR7,AalOR10, AalOR88的全长序列,包括5’和3’非编码基因序列。2.利用HMMTOP version 2.0和TMHMM server version 2.0软件预测白纹伊蚊AalOR7属于7次跨膜蛋白,并且具有形成离子通道的钙调蛋白结合位点calmodulin (CaM) binding site (329SAIKYWVER337). AalOR10属于7次跨膜蛋白,AalOR88属于6次跨膜蛋白。AalOR10和AalOR88不具备钙调蛋白结合位点,但是实验证明传统嗅觉受体具有识别气味的功能。3.白纹伊蚊嗅觉受体的表达具有时空特异性。其中,AalORs 7,10,14,45,59,88和105在雌蚊的嗅觉组织中特异性表达。4.在异源表达系统(HEK293细胞和转基因果蝇)中,传统的嗅觉受体(ORXs)与Orco能够形成异源复合物,该异源复合物是探测气味分子和传递刺激的基本嗅觉功能单位。该异源复合物能够识别并对人类挥发物等气味分子做出反应。5.RNA干扰可成功降低白纹伊蚊嗅觉基因AalOR7、AalOR10、AalOR88的表达水平。6.降低AalOR10和AalOR88的Mrna表达量不会引起雌蚊的嗅觉行为的明显改变。只有降低AalOR7的表达水平,雌蚊才会表现出明显的嗅觉行为缺陷,出现了寻找吸血宿主的缺陷和丧失对人类宿主偏好性。同时,AalOR7-siRNA干扰后白纹伊蚊雌蚊触角对气味分子无明显的触角电位反应。