目的:进行性肌营养不良(progressive muscular dystrophy,PMD)是一组以进行性加重的肌无力、肌萎缩为主要临床表现的遗传性骨骼肌疾病的总称。由于患者编码肌细胞相关蛋白的基因变异,造成蛋白缺陷或功能障碍,导致肌细胞的完整性遭到破坏,其中Duchenne肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)在各类肌营养不良中发病率最高,约为1/3500男婴,且无地域和种族间明显差异。DMD是一种X连锁隐性遗传性疾病,其致病基因位于X染色体的Xp21区,为编码dystrophin蛋白的基因发生缺失、插入和点突变,dystrophin蛋白的功能缺失引起肌纤维的变性和坏死。女性多为致病基因携带者,发病者罕见,且症状较轻。DMD发病年龄偏小,起病隐袭,且病死率高,受到广泛关注。目前关于DMD的发病机制尚不清楚,涉及到很多常见的机制,例如钙离子内流,炎症细胞浸润,促炎和促进纤维化细胞因子的激活,各种蛋白水解酶的活化,自噬的缺陷和细胞凋亡等。研究显示局部的炎症反应是肌肉纤维化和脂肪组织渗透的触发点,最终导致肌细胞纤维化并由脂肪组织替代,失去功能。在炎症反应中,巨噬细胞浸润起着关键作用,如激活的巨噬细胞能产生NO来裂解肌细胞,同时作为主要的促炎因子,通过激活蛋白水解酶系统和抑制肌肉再生引起肌肉萎缩等。巨噬细胞表达基因1(Macrophage expressed gene 1,mpeg1)是首个被发现高表达于人类和鼠科动物巨噬细胞内的基因。先前的实验显示在斑马鱼中转入mpeg1基因后巨噬细胞系反应明显增加,这就使得嗜中性粒细胞与巨噬细胞得以分别被研究,说明mpeg1特异性表达于巨噬细胞内。C57BL/10Sc Sn Dmd mdx/JNju小鼠(X-linked muscular dystrophy mouse,X-连锁肌萎缩小鼠,简称mdx小鼠)为编码dystrophin蛋白的3185位基因自发突变,使该位点编码谷氨酰胺的密码子变成了终止密码子,导致基因的表达提前终止,造成其编码的蛋白缩短。该模型鼠与DMD患者有相同的遗传基础,已经被广泛用于DMD研究的各个领域。本实验欲通过组织化学染色方法观察mdx小鼠不同骨骼肌的病理改变,利用基因芯片技术筛选与炎症相关基因在疾病不同时期的动态表达,进一步通过实时定量PCR(q RT-PCR)技术观察mpeg1在mdx小鼠及对照鼠中的表达。探讨巨噬细胞相关性炎症在mdx小鼠中的作用,进而通过抑制巨噬细胞相关性炎症反应来改善肌肉质量,为DMD提供新的治疗靶点。方法:选取雄性C57BL/10Sc Sn-Dmdmdx/JNju鼠(购于南京大学模式动物研究所)为实验组,对照组为雄性C57BL/6Sc Sn小鼠,根据年龄分为2w、4w、8w、12w。每组各时间点选取6只,3只用于常规组织化学染色,3只用于基因芯片检测和q RT-PCR测定。以10%水合氯醛(350mg/Kg体重)腹腔注射麻醉,取小鼠股四头肌、腓肠肌、胫骨前肌、肱二头肌、心肌,进行包埋冰冻处理。设置切片厚度为8um,做连续切片。分别对冰冻切片行常规染色,包括HE染色、MGT染色、ACP染色观察其光镜下的形态学变化,总结mdx小鼠骨骼肌炎性病理变化;小鼠麻醉后,取小鼠股四头肌迅速投入液氮冷冻,之后保存于-80℃冰箱,用于m RNA提取,基因芯片的检测及mpeg1的q RT-PCR检测,结果应用spss13.0对数据进行分析。结果:1利用常规组织化学方法,我们观察到2w的mdx小鼠股四头肌、腓肠肌、胫骨前肌和肱二头肌中肌细胞大小基本一致,偶见高度浓染的肌纤维,未见肌细胞坏死,炎症细胞浸润;4w可见巨噬细胞吞噬现象散在分布,偶见小灶样分布;8w时炎细胞浸润灶融合成片,12w时炎性病灶面积减小;mdx小鼠心肌中未见到变性、坏死和炎细胞浸润;同龄对照鼠各骨骼肌中未见上述病理改变;2利用基因芯片技术对mdx小鼠股四头肌进行m RNA测定,筛选出有关炎症反应的基因30余个,结果显示与2w相比,炎症反应相关基因随疾病进展表达量增加,在8w时达到峰值,12w有所下降,但较2w时仍有升高,差别具有统计学意义(P<0.05);3利用q RT-PCR技术对mpeg1基因进行定量分析,结果显示在2w时,mdx小鼠与对照鼠之间mpeg1的含量无差别;从4w开始,mdx小鼠中mpeg1的含量逐渐增加,8w时含量最高,与对照鼠同周龄间差别有统计学意义(P<0.05),但mdx小鼠4w、8w、12w之间表达量差别无统计学意义;而对照鼠各周龄间差别无统计学意义;结论:1炎症反应参与mdx小鼠疾病的发生发展:从2周开始出现,8周达到高峰,12周趋于平稳;2 Mpeg1在mdx小鼠炎症反应中发挥了一定的作用。