1,5-戊二胺是一种具有生物活性的碱性胺类化合物,作为重要的生物基尼龙PA 5X的单体,具有巨大的商业价值。目前工业上主要采用全细胞催化的方法来生产1,5-戊二胺,其生产效率受制于赖氨酸脱羧酶的催化性能。随着碱性产物积累,赖氨酸脱羧酶易发生解聚从而失活,因此在反应过程中需要添加大量的酸来维持低pH。如能提高赖氨酸脱羧酶在碱性条件下的稳定性,使酶在高pH条件下仍保持较高的活性,可以减少酸碱用量,对大规模工业化生产1,5-戊二胺具有重要意义。同时,考虑到较高的反应温度可以增加底物溶解度、加快反应速率,因此,本文采用定向进化和理性设计相结合的策略,对来源于大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶CadA进行改造,以期获得耐碱、耐高温的突变体。首先,本研究基于脱羧反应过程中pH上升的特点,选择合适的酸碱指示剂建立了pH8.0初始反应条件下的赖氨酸脱羧酶高通量筛选方法,并通过高效液相色谱对该方法的有效性进行验证。利用此高通量筛选方法,对大肠杆菌来源的诱导型赖氨酸脱羧酶进行定向进化,筛选得到K477R、F102V两个单点突变体,其在50℃、pH8.0下的酶活分别提高了 1 5%和10%。随后借助计算机辅助技术,对赖氨酸脱羧酶十聚体界面上的4个氨基酸位点使用iStable、CUPSAT以及Rosetta-ddG进行虚拟饱和筛选,对至少两个以上软件预测稳定性提高的突变体进行实验验证,获得的最优突变体E445Q在50℃、pH 8.0下的酶活提高了 13%。结合前人研究得到的稳定性提高的单点突变体T88S,经组合突变得到活性提高的两点突变体K477R/E445Q和四点突变体K477R/E445Q/T88S/F1 02V,其在50℃、pH 8.0下的酶活分别提高了 24%和37%。对野生型和突变体进行酶学性质分析,发现5个阳性突变体在碱性条件下（pH7.5-9.0）的酶活以及在50℃、pH 8.0和50℃、pH 9.0下孵育2h后的剩余酶活较野生型均有所提高;并且最适温度以及熔化温度（Tm值）也都有所提高,表明这5个突变体的耐碱、耐热性能都得到了改善。对动力学参数进行考察,发现K477R、K477R/E445Q和K477R/E445Q/T88S/F102V催化效率（Kcat/Km）的提高主要是由于其Km值的下降,说明K477R突变增加了酶对底物的亲和性。最后,通过分子动力学模拟对赖氨酸脱羧酶突变体耐热、耐碱的原因进行了分析。RMSF（Root Mean Square Fluctuation）分析发现,各突变体中均有1-2个局部区域的刚性增强,表明局部结构的刚性增强提高了蛋白在高温、高pH条件下的稳定性;同时,各突变体中盐桥数目均较野生型有所增加,表明盐桥的引入对稳定性的增加起到重要作用;此外,在K477R和E445Q突变体中,亚基之间的作用力有所增强,表明对于赖氨酸脱羧酶这类由亚基解离导致失活的蛋白质,可通过增强亚基之间的作用力提升其稳定性。本研究采用定向进化以及理性设计相结合的策略,提高了赖氨酸脱羧酶CadA在碱性高温条件下的催化活性,并利用分子动力学的轨迹分析探究了其稳定性提高的机制,为其他蛋白质的稳定性改造提供了一定的借鉴作用。