【摘 要】
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丙肝是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种病毒性肝炎,呈全球流行,每年全球用于丙肝治疗费用超过1000亿美元。大多数丙型肝炎病毒感染者为持续性感染,进而引起慢性肝脏炎症或坏死、肝硬化甚至部分感染者可转化为肝癌。现有的治疗药物只对部分丙肝病毒感染者有效,且治疗时间长,成本高和具有副作用。疫苗是预防病毒性疾病的一种经济、简单和有效的手段。丙肝病毒为单股正链RNA病毒,具有显著异源性和高度可变性,目前还没
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丙肝是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种病毒性肝炎,呈全球流行,每年全球用于丙肝治疗费用超过1000亿美元。大多数丙型肝炎病毒感染者为持续性感染,进而引起慢性肝脏炎症或坏死、肝硬化甚至部分感染者可转化为肝癌。现有的治疗药物只对部分丙肝病毒感染者有效,且治疗时间长,成本高和具有副作用。疫苗是预防病毒性疾病的一种经济、简单和有效的手段。丙肝病毒为单股正链RNA病毒,具有显著异源性和高度可变性,目前还没有针对丙肝病毒的疫苗。因此,研发丙肝病毒基因工程疫苗具有重要的科学价值。本研究基于我国丙型肝炎病毒基因型I（Beijing 1b）的氨基酸序列,合成丙型肝炎病毒包膜蛋白E1/E2中的6个保守序列Bp(E1313-327aa、E2396-424aa、E2438-447aa、E2523-540aa、E2610-627aa、E2631-648aa)、模拟抗原表位R9肽和免疫佐剂热敏肠毒素B单位（LTB）的基因,构建表达这些多表位基因的表达载体p ET28a-LTB-R9-Bp和p ET28a-R9-Bp。通过测序鉴定,成功获得表达多表位疫苗基因的重组质粒。在大肠杆菌系统中摸索高效稳定表达LTB-R9-Bp和R9-Bp蛋白的条件,大量表达蛋白使用镍柱进行纯化,我们最终成功获得了纯化的目的蛋白。纯化后的LTB-R9-Bp和R9-Bp蛋白用IP、IM、Oral三种免疫方式对昆明鼠进行免疫,收集抗血清检测诱导的体液免疫反应。ELISA结果显示:腹腔注射组中,融合表达的LTB-R9-Bp抗体效价达到1:341000,而R9-Bp蛋白抗血清最高稀释度为1:85000,两者有显著差异,说明LTB具有免疫增强作用;肌肉注射组,重组LTB-R9-Bp和R9-Bp蛋白免疫小鼠后均引起了小鼠的体液免疫应答,但诱导的抗体水平相当;LTB是良好的口服免疫佐剂,尝试将LTB-R9-Bp蛋白口服免疫小鼠,未检测到很好的免疫效果。利用Real-time PCR检测免疫小鼠脾细胞中IL-4和IFN-γ细胞因子的表达水平,发现免疫LTB-R9-Bp和R9-Bp蛋白的实验组中细胞因子含量均高于对照组,表明LTB-R9-Bp和R9-Bp蛋白能引起小鼠的细胞免疫。通过Western Blot检测LTB-R9-Bp和R9-Bp抗血清与HCV病毒蛋白的反应,结果显示自制的抗血清可以特异性识别HCV病毒抗原E1和E2。为了研究LTB-R9-Bp和R9-Bp免疫得到的抗血清能否在一定程度上抑制HCV感染,设计病毒中和实验将不同稀释度的血清与病毒一起孵育后感染Huh7细胞,结果发现来自LTB-R9-Bp和R9-Bp免疫的抗血清可以部分保护细胞免受丙肝病毒的感染,且呈抗体剂量依赖性。以上结果说明,丙肝病毒多表位抗原LTB-R9-Bp和R9-Bp蛋白具有良好的免疫原性和免疫特异性,进一步加深了我们对HCV的包膜蛋白E1和E2作为疫苗开发潜在的认识。且小鼠产生的针对丙肝病毒多抗原表位蛋白的血清抗体对病毒有一定的中和作用。为研制丙肝病毒多抗原表位基因工程疫苗奠定初步的实验基础。
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