骨关节炎(OA)是老年人活动能力丧失的最重要原因。随着世界范围的老龄化趋势,OA的发病率呈持续增长。但是,由于缺乏对其发病机理的深入认识,目前尚无有效的预防及治疗方法。OA可在多个关节发病,但多数发生在髋关节和膝关节,国人多累及膝关节,尤其多见于绝经后女性。OA的特征性病变为关节软骨的破坏,病变逐步发展可导致关节软骨下骨的硬化、囊性变,关节囊增厚、纤维化等,最终关节变形,功能丧失。在OA中,软骨基质代谢的失衡与关节软骨破坏直接相关。促进软骨基质的合成代谢,抑制分解代谢有望延缓甚至逆转关节软骨的破坏过程,成为目前研究重点。在OA软骨分解代谢过程中,基质金属蛋白酶(MMP)活性显著增加,是目前OA药物靶向治疗的研究热点。他汀类药物能显著降低粥样动脉硬化患者的病死率,其机理为抑制粥样斑块内MMP的表达和活性,稳定胶原基质,从而降低斑块破裂的机率。在心血管以外的其它组织中,也有他汀抑制MMP的活性的研究报道。同时,他汀具有抑制炎症反应的作用。因此,本课题设想他汀能通过此机制抑制OA中软骨的破坏。本研究在细胞、组织和动物体内三个水平探讨了辛伐他汀对OA软骨的保护作用。首先在软骨细胞原代培养中,利用明胶酶谱法检测辛伐他汀处理前后软骨细胞产生MMP-2活性的变化;然后建立体外软骨组织块培养模型,观察辛伐他汀对软骨基质分解代谢的影响;最后建立兔膝关节OA模型,探讨辛伐他汀对OA的治疗作用。本研究的内容和结果如下。1.辛伐他汀对兔关节软骨细胞活性的影响取4周龄新西兰兔双侧膝关节关节软骨,用II型胶原酶消化后分离软骨细胞进行原代培养。第三代细胞进行体外药物实验,分为辛伐他汀组、双氯芬酸组、地塞米松组及空白对照组,药物终浓度设为0.01μM,0.1μM,1μM和10μM。加入药物培养48 h后,采用MTT法检测各种药物对细胞活性影响。结果表明,本实验所采用的各种浓度的辛伐他汀及双氯芬酸和地塞米松对软骨细胞活性无明显影响,可用于进一步实验。2.辛伐他汀对IL-1α诱导软骨细胞表达MMP-2活性的作用取第三代软骨细胞,分为辛伐他汀组、双氯芬酸组、地塞米松组及空白对照组,用5ng/ml浓度的IL-1α以刺激软骨细胞,并以不同浓度辛伐他汀、双氯芬酸钠及地塞米松处理。培养48h后收集培养上清,用明胶酶谱法检测上清,以评价软骨细胞释放至其中的MMP含量。结果表明,IL-1α可刺激软骨细胞高表达MMP-2,辛伐他汀能抑制MMP-2的表达,并呈剂量依赖性;而双氯芬酸钠和地塞米松没有明显的抑制作用。3.辛伐他汀对软骨基质蛋白多糖降解的抑制作用取4 w龄新西兰大白兔的双侧膝关节软骨面,用直径4 mm的空心钻头钻取大小一致的圆盘状软骨,并用手术刀片修整其厚度约为1mm。将软骨组织块移至24孔板中,分别给予不同浓度辛伐他汀、双氯芬酸钠及地塞米松预处理,再用5 ng/ml浓度的IL-1α诱导软骨基质降解,在5% C02,37℃条件下培养48h后收集培养上清。采用经典的1,9-二甲基亚甲蓝法检测糖胺聚糖(GAG)的含量,以评价蛋白多糖的降解程度。结果发现在空白对照组中,仅有微量GAG的释放。而含有IL-1α的组则有显著的GAG释放。辛伐他汀可抑制软骨基质中蛋白多糖及胶原的降解,并与药物浓度成正比;而双氯芬酸钠及地塞米松对蛋白多糖的降解没有作用。4.辛伐他汀对软骨基质胶原降解的抑制作用按前一实验方法建立软骨组织块培养模型,分别给予不同浓度辛伐他汀、双氯芬酸钠及地塞米松预处理,再用5ng/ml浓度的IL-1α诱导软骨基质胶原降解,组织块共培养21 d,每周更换培养基一次。采用碱水解法检测上清中羟脯氨酸释放的量,以其占总羟脯氨酸含量的百分比来评价胶原降解的量。结果表明,在空白对照组中,几乎没有羟脯氨酸的释放。而含有IL-1α的组则有显著的羟脯氨酸释放,并且随着培养时间的延长而逐渐增高。辛伐他汀可抑制软骨基质中胶原的降解,并与药物浓度成正比;而双氯芬酸钠未显示出对胶原降解的抑制作用,地塞米松对对胶原的降解在低浓度时没有抑制作用,只有在高浓度情况下才有抑制作用。5.兔OA模型的建立及评价取20只成年新西兰兔,体重2.5~ 3.0kg。所有动物随机分为假手术对照组(10只)和前交叉韧带切断(ACLT)造模组(10只)。ACLT造模组所有动物用手术切断右侧膝关节前交叉韧带,笼养,不限制活动,而假手术对照组仅行手术切开暴露而不切断前交叉韧带。术后8 w处死所有动物,取术侧股骨、胫骨关节软骨及滑膜,软骨标本进行大体观察及墨迹染色评级;并固定脱钙、石蜡包埋、制备切片,分别进行苏木精-伊红染色及番红花-固绿染色,根据改良的mankin评分系统进行评分。结果表明,ACLT造模组关节与对照组相比,有显著的滑膜炎症及关节软骨退变表现,并且其墨迹染色评级与组织学评分之间存在良好的相关性。在关节软骨的所有部位中,以股骨外侧髁(LFC)的软骨退变与对照组相比最为显著,是此种OA模型中进行关节软骨退变研究的优先选择部位。6.辛伐他汀对兔OA的治疗作用取40只成年新西兰兔,体重2.5~ 3.0kg。所有动物随机分为假手术正常对照组(10只)、辛伐他汀组(10只)、双氯芬酸钠组(10只)、安慰剂组(10只)。手术造模按上一实验步骤进行。术后1w开始每天药物灌胃,各组分别给予辛伐他汀10mg/kg、双氯芬酸钠10mg/kg;安慰剂组给予相应体积的0.5%羧甲基纤维素溶液。术后9w取术侧股骨外侧髁关节软骨及关节滑膜,软骨标本进行大体观察、墨迹染色评级及组织学评分。同时,用免疫组织化学的方法评价各组软骨标本中MMP-2的活性。结果表明,辛伐他汀治疗组关节软骨破坏较轻,评分显著低于安慰剂组,而且MMP-2的表达也显著低于安慰剂组和双氯芬酸组。辛伐他汀组及双氯芬酸钠组关节滑膜炎症反应都较安慰剂组为低。