目的:弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)是一种常见的颅脑损伤类型,其特点是症状危重、昏迷时间长、伤残率及死亡率高。DAI的形成包括一系列病理生理学变化过程,除了剪应力直接作用形成的原发性损伤外,脑损伤后的继发性改变如缺血、缺氧、水肿等引起的损伤更为严重。伴随DAI产生的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏,及由之引起的脑水肿等继发性损伤是导致本病预后较差的主要原因。近年来发现的水通道蛋白4(Aquaporin-4,AQP4)与DAI后脑水肿的形成关系密切,但AQP4是否引起BBB通透性的改变,以及Ca2+是否与二者有关联尚不清楚。研究证明在大鼠脑出血模型中,Ca2+拮抗剂尼膜同能够下调脑组织AQP4 mRNA表达,降低BBB通透性,从而抑制脑水肿。本实验拟通过动态观察大鼠DAI后脑组织含水量、BBB通透性和AQP4的表达,以及使用尼膜同后的变化,探讨DAI后脑水肿的发生机制,从而为DAI防治提供理论依据。方法:健康雄性成年SD大鼠110只,体重350-375g,由河北医科大学实验动物中心提供。按完全随机分组原则分为3组:对照组、DAI组和尼膜同治疗组。对照组10只,DAI组和尼膜同治疗组各50只。后两组再各随机分为6h、1d、3d、5d、7d组5个亚组,每个亚组10只大鼠。DAI组按照Marmarou等的方法制作大鼠DAI模型;尼膜同治疗组腹腔注射尼膜同(0.5mg/kg体重)20min后,按照Marmarou等的方法制作大鼠DAI模型,以后每24h注射1次尼膜同(剂量同前);对照组大鼠切开头皮暴露颅骨后直接缝合。造模后大鼠常规进食。从DAI组和尼膜同治疗组每个亚组中随机抽取五只大鼠,连同从对照组中随机抽取的五只大鼠,按预定时间,4%多聚甲醛溶液灌注后断头取脑,沿正中矢状线将脑组织分为左右两部分。左半脑组织立即进行脑组织含水量的测定;右半脑组织常规固定、脱水、透明、石蜡包埋后连续切片厚度4μm,进行相应染色、观察。取上述各时间点的左半脑组织,采用干湿重法计算脑组织含水量,以此代表脑水肿的程度。各组中剩余的大鼠均采用分光光度法检测各时间点的脑组织中伊文思兰(evens blue,EB)的含量,以定量评价BBB功能损害的情况。在光镜下,通过对标本的HE染色观察DAI后脑水肿的变化,如细胞水肿、细胞间隙和血管周围间隙增宽程度等。通过对标本的免疫组化染色观察细胞胞膜呈棕黄色或褐色深染的AQP4蛋白阳性表达。采用Motic6.0数码医学图像分析系统定量分析每个视野阳性目标平均吸光度值(OD),代表AQP4的表达强度。应用SPSS13.0统计学软件,所得数据均以均数±标准差( x±s)表示。两组间比较采用两样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,当方差分析有显著性差异时,进一步用q检验作两两比较;以及根据实验要求作直线相关性分析。以P<0.05作为判断差异有无统计学意义的标准。结果:1肉眼及光镜观察结果肉眼观察:DAI组和尼膜同治疗组可见软脑膜血管扩张淤血,散在的点灶状蛛网膜下腔出血,未见明显的脑挫伤及脑实质内出血;HE染色:DAI组可见脑组织疏松水肿,细胞空泡样变,细胞间隙和血管周围间隙增宽。尼膜同治疗组病理变化较DAI组轻。对照组无上述病理变化;免疫组化染色:DAI组可见室管膜、软脑膜和血管周围的星形胶质细胞胞膜呈棕黄色或褐色深染的AQP4阳性表达。尼膜同治疗组AQP4表达较DAI组稍弱,但强于对照组。对照组AQP4呈弱阳性表达。2脑组织含水量的变化DAI组和尼膜同治疗组脑组织含水量均呈现一个由低向高,到达顶峰后逐渐降低的过程。从致伤后6h开始增加,1d达到高峰,之后开始下降,7d脑组织含水量仍高于正常。与对照组比较,DAI组和尼膜同治疗组都具有统计学差别(P<0.05)。尼膜同治疗组达到高峰时间与DAI组相同,但6h、1d、3d、5d脑组织含水量均低于DAI组(P<0.05),7d脑组织含水量无明显差异(P>0.05)。3 BBB通透性的变化(EB含量的变化)DAI组和尼膜同治疗组BBB通透性均呈现一个逐渐上升,到达顶峰后缓慢降低的过程。从致伤后6h开始升高,1d~3d时最高(1d与3d比较无明显差异),之后逐渐降低,7天BBB通透性仍高于正常。与对照组比较,DAI组和尼膜同治疗组都具有统计学差别(P<0.05)。尼膜同治疗组的变化与DAI组相似,但各对应时间点BBB通透性均低于DAI组(P<0.05)。4脑组织AQP4表达的变化DAI组和尼膜同治疗组脑组织AQP4表达均呈现一个由低向高,到达顶峰后逐渐降低的过程。从致伤后6h开始增加,3d达到高峰,之后开始下降,7d脑组织AQP4表达仍高于正常。与对照组比较,DAI组和尼膜同治疗组都具有统计学差别(P<0.05)。尼膜同治疗组达到高峰时间与DAI组相同,但各对应时间点AQP4表达均低于DAI组(P<0.05)。5脑含水量、EB含量、AQP4表达的相关分析大鼠DAI后脑含水量、EB含量与AQP4表达的变化规律一致,相关分析显示脑含水量与AQP4表达正相关(r=0.824,P<0.01);EB含量与AQP4表达也呈正相关(r=0.871,P<0.01)。结论:1大鼠DAI后脑组织含水量、BBB通透性、AQP4表达均呈现一个由低向高,到达顶峰后开始逐渐降低的过程。AQP4蛋白的变化规律,与脑组织含水量、BBB通透性呈正相关,证实AQP4与DAI后脑水肿的形成,BBB损伤之间存在密切正相关关系。2给予尼膜同治疗后,与DAI组相比,脑组织含水量、BBB通透性、AQP4表达在各对应时间点均有明显的差异(P <0.05)。表明尼膜同通过降低DAI后AQP4的表达,降低BBB通透性,减轻脑水肿,在DAI后BBB的修复过程中发挥一定的作用。