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研究背景结直肠癌是严重威胁人类健康的常见消化道恶性肿瘤。目前以手术为基础的综合治疗在大肠癌中发展迅速,尤其是化疗及分子靶向药物的发展及多学科诊疗模式(MDT)的建立,有效提高了大肠癌患者的生存,但统计结果显示其发病率及疾病相关死亡率仍上升非常明显。其中肿瘤转移是影响患者预后及致死的关键因素。大肠癌转移是一个十分复杂的过程,涉及多因素、多步骤,多条信号转导通路交联,相互影响。而上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)在大肠癌侵袭及转移中的作用越来越受到关注。在分子水平上对结直肠癌相关基因的研究已经较为深入,近些年越来越多的临床及基础科研工作者开始关注microRNAs (miRNAs, miRs)在大肠癌发生发展中的作用。miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,通过和靶基因1mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译过程。目前已有研究证实miRNAs在大肠癌早期诊断,预后判断及疗效预测中发挥作用。另外miRNAs在大肠癌细胞增殖及凋亡,新生血管生成等基础研究领域亦不断有数据更新。尽管miRNAs参与肿瘤发生及细胞凋亡的相关研究较多,但有关miRNAs介导EMT的研究仍较少。课题组之前曾关注miRNAs与肿瘤耐药的相关研究,发现1niR-200c能够抑制多药耐药基因及P-糖蛋白从而逆转乳腺癌对表柔比星的耐药。本课题依托前期miRNAs研究基础,以细胞粘附、肿瘤微环境及EMT为切入点,研究miR-194参与大肠癌EMT过程及侵袭、转移中的作用。实验方法及结果首先课题组结合前期实验基础及miRNAs芯片筛选结果,收集临床结直肠癌标本40例,利用stem-loop RT-qPCR法检测标本中：miR-194的相对表达并统计其与临床病理特征的相关性。结果显示在淋巴结阳性的原发肿瘤中miR-194的表达明显强于淋巴结阴性组,而患者不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、浸润深度与1niR-194的表达无明显相关性。这些结果提示miR-194可能在结直肠癌侵袭及转移中发挥作用。其次课题组寻找研究miR-194在大肠癌中侵袭转移中作用的细胞模型,发现在同源性较好的大肠癌细胞系SW480与SW620中,SW620细胞miR-194相对表达明显高于SW480细胞,细胞的划痕及Transwell迁移及侵袭实验均证实了SW620细胞的迁移、侵袭能力明显强于SW480细胞。进一步研究发现在SW620细胞系中MMP-2在1mRNA及蛋白质水平上表达均明显高于SW480细胞系,但MMP-9mRNA表达两株细胞无明显差别。上皮标志物E-cadherin在SW480表达明显强于SW620,司质标志物Vimentin则呈相反的变化。因此证实MMP-2, E-cadherin, Vimentin在大肠癌EMT转化中发挥重要作用,SW480与SW620是miR-194功能研究的良好细胞模型。之后课题组将miR-194构建质粒载体稳定转染入相对低表达的SW480细胞中,筛选高表达miR-194的细胞克隆,成功建立稳定转染细胞系niR-194-480。细胞形态学观察发现稳定转染后的miR-194-480细胞由转染前的扁圆形转变为梭形,发生明显的间质性改变。细胞增殖MTT实验显示miR-194转染SW480后,细胞增殖能力并未见明显变化。而迁移、侵袭实验结果则表明稳转细胞系miR-194-480在细胞迁移、侵袭能力方面大大增强。因此,我们认为1niR-194可能对大肠癌细胞增殖影响不大,却明显增加了大肠癌细胞的迁移、侵袭能力。之后RT-qPCR及Western Blot以及明胶酶谱实验证实,高表达miR-194能够增加MMP-2蛋白表达及活性,降解细胞外基质,同时E-cadherin表达下降,而Vimentin则明显表达增强。因此证实miR-194通过增加MMP-2, Vimentin表达,降低E-cadherin表达,在大肠癌EMT改变中发挥重要作用。同样,细胞骨架染色实验证实miR-194-480细胞系在细胞微丝数量上明显多于未转染细胞系。这说明miR-194在大肠癌细胞中能够影响细胞微丝,改变细胞骨架,增加大肠癌细胞的迁移、侵袭能力。接下来课题组对miR-194可能参与的细胞信号转导通路进行了预测。经生物信息学筛选,TargetScan, miRanda, RNA22等miRNA靶基因预测软件预测,PKC有可能是miR-194的靶标,PKC对ERK通路的活化也是目前的研究热点。课题组预想miR-194是否通过PKC的活化,从而激活ERK通路,参与大肠癌EMT转化。但实验结果与预期差异较大,在阴性对照组及转染组均未检测到PKC-α的表达,分析原因可能是miR-194参与了其他通路而反馈抑制了PKC-α,当然不能排除自身实验技术的不够成熟。由于课题时间有限未能更进一步深入探究。结论miR-194在淋巴结阳性的结直肠癌患者中高表达,而与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、浸润深度无明显相关性；miR-194通过调节MMP-2, E-cadherin, Vimentin的表达,参与大肠癌细胞EMT,能够明显增加大肠癌细胞的迁移、侵袭能力；miR-194参与大肠癌EMT过程中伴随细胞骨架的改变；PKC通路可能在miR-194参与大肠癌EMT转化过程中不起关键作用。