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目的京尼平苷是中药栀子的主要活性成分,为小分子化合物。近年来研究表明京尼平苷具有多种生物活性,但是揭示其作用精确分子机制的研究较少。课题组前期通过虚拟筛选预测、利用亲和层析靶钓和体外细胞药物摄取实验,表明糖皮质激素受体与京尼平苷存在作用关系。但是体内二者是否存在相互作用,这一点尚不清楚。本研究旨在通过指数富集配体进化系统（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX）技术获得与京尼平苷特异性结合的核酸适配体,并初步探索以得到的京尼平苷核酸适配体为工具,研究小鼠脑内京尼平苷与糖皮质激素受体的作用关系。为进一步研究京尼平苷分子机制提供实验依据,为研究中药小分子的作用靶点和分子机制提供新思路和新方法。方法本研究主要包括四部分内容:第一部分,依据SELEX技术原理,采用构象改变方法,以京尼平苷为正筛靶分子,以京尼平和葡萄糖为反筛靶分子,进行体外筛选。通过测定核酸文库偶联固定率、PCR条件优化、洗脱量百分数、洗脱液清洗液比对、实时定量荧光PCR等方法对富集效果检测,监测筛选过程,不断优化筛选条件;第二部分,当核酸文库富集到一定程度后对其含有的全部核苷酸链进行高通量测序,选取主导核苷酸链作为研究对象。进一步分析其二级结构、亲和力和特异性,并最终得到特异性、亲和力较好的适配体;第三部分,采用超高效液相色谱联合质谱方法对小鼠脑内京尼平苷进行鉴定,以确定其是否在给药组脑组织匀浆中存在。以生物素标记的适配体作为研究与京尼平苷作用蛋白的工具,进行共沉淀实验。以链霉亲和素标记的琼脂糖树脂为固相,固定京尼平苷的适配体,沉淀脑内京尼平苷-蛋白复合物,经SDS-PAGE、Western Blot验证沉淀得到的蛋白中是否存在糖皮质激素受体;第四部分,以带有荧光基团的适配体作为工具,联合糖皮质激素受体抗体,对小鼠脑组织冰冻切片上的京尼平苷和糖皮质激素受体进行荧光双标记,在荧光显微镜下观察共定位,研究糖皮质激素受体与京尼平苷在位置上的关系。结果1.核酸文库偶联固定率为89.9%,表明核酸文库固定良好;PCR条件优化,退火温度55℃、延伸时间10 min时PCR扩增结果最佳,提示PCR各阶段反应条件适宜,可以有效得到特异性扩增产物;筛选进行第10轮时,两个洗脱液DNA含量均明显高于清洗液;第10轮核酸文库的京尼平苷洗脱量百分数明显高于初始核酸文库,缓冲液的洗脱量百分数未见明显变化,京尼平和葡萄糖混合物的洗脱量百分数明显高于初始核酸文库,与京尼平苷的洗脱量百分数大致相同,表明筛选过程有效且富集效果良好,但特异性差,需要引入反筛;筛选进行至第16轮时,反筛洗脱量百分数较为稳定,在3%左右,而正筛洗脱量百分数逐渐增高,稳定在25%左右,提示可结束筛选。2.对得到的核酸文库进行高通量测序,在整个分子库中,第一名（geniposideaptamer 1,GP1）核苷酸链含有934条拷贝,第二名（geniposideaptamer2,GP2）核苷酸链占有713条拷贝,其余核苷酸链含有的拷贝数较小,低于300;Mfold Web Server预测GP1的二级结构含有一个发夹和一个内部隆起,GP2有两个发夹和一个三向连接元件,提示GP1的内部隆起和GP2的三向连接元件有可能为京尼平苷的结合位点;GP1和GP2的Kd,eff1分别为17.7nM和16.8nM,GP1和GP2的Kd,eff2分别为0.0029和0.0086,通过公式Kd=Kd,eff1/Kd,eff2计算得到GP1和GP2的Kd值分别为～6.1 μM和～2.0 μM,亲和力均达到微摩级别;特异性检测时,京尼平、葡萄糖和小鼠脑组织匀浆均无法引起荧光强度的增高,与京尼平苷引起的荧光强度增高相比存在显著差异,表明GP1和GP2均不与京尼平苷体内代谢产物和小鼠脑组织匀浆相互作用。3.正离子模式下检测各样品一级二级质谱数据,比对京尼平苷标准品,在相同保留时间内,C-G组分别含3个、7个、5个、8个、7个与京尼平苷标准品相同的离子峰,各给药组与标准品的特征性离子峰一致,与参考文献相符,表明本实验给药条件下,京尼平苷在小鼠脑内存在;基于适配体的“共沉淀”实验蛋白印迹结果显示,input中有条带,三组上清液中均有条带,洗脱液中只有京尼平苷脑匀浆组有微弱条带,提示琼脂糖树脂、适配体GP2不引起假阳性,小鼠脑内京尼平苷与糖皮质激素受体存在相互作用关系。4.适配体GP2对空白对照组小鼠脑组织冰冻切片染色后无特异性荧光信号,对京尼平苷组小鼠脑组织冰冻切片染色后有绿色荧光信号,表明GP2不与对照组小鼠脑组织冰冻切片发生特异性染色,可用于在小鼠脑组织冰冻切片上对京尼平苷进行定位;GP2对经糖皮质激素受体荧光染色处理的小鼠脑组织冰冻切片染色时无特异性荧光信号,表明可通过适配体“共定位”方法,在小鼠脑组织冰冻切片上研究二者共定位关系;基于适配体的“共定位”实验结果显示,皮层神经元部位可见绿色荧光与红色荧光重叠,呈黄色,提示二者存在共定位,小鼠脑内京尼平苷与糖皮质激素受体存在潜在的相互作用关系。结论本研究SELEX实验方案设计良好,适于京尼平苷适配体的筛选。首次获得了京尼平苷亲和性和特异性较好的核酸适配体GP2。进而应用GP2,初步探索小鼠脑内京尼平苷与糖皮质激素受体的作用关系。结果表明小鼠脑内京尼平苷与糖皮质激素受体存在相互作用。本研究以京尼平苷为模式,建立了 SELEX技术筛选中药小分子适配体的平台。初步表明适配体可应用到药物与蛋白质相互作用研究的领域中,为研究中药小分子的作用靶点和分子机制提供了新思路和新方法。