目的：　　1.观察呼吸道上皮细胞短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)在肺炎链球菌（SP）感染条件下的表达。　　2.研究白藜芦醇（ Res）对SP感染的呼吸道上皮细胞SPLUNC1表达的调节。　　3.探讨核转录因子-κB（NF-κB）在Res调节SP诱导的呼吸道上皮细胞表达SPLUNC1中的作用。　　方法：　　培养SP菌株，制备菌悬液。BEAS-2B细胞、A549细胞接种于6cm细胞培养皿或96孔板，置于细胞培养箱，37℃、5％ CO2条件下培养，至细胞70%～80%融合，加入菌悬液，建立SP感染呼吸道上皮细胞模型，具体实验方法如下：　　1.观察SP感染对呼吸道上皮细胞活性的影响　　根据感染复数（multiplicity of infection，MOI）不同将SP感染BEAS-2B细胞、A549细胞各自分为MOI0 SP组、MOI20 SP组和MOI50 SP组（感染复数分别为0、20、50），予 SP感染0h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h，进行CCK8实验，检测细胞活力。　　2.观察SP诱导呼吸道上皮细胞SPLUNC1表达　　MOI20 SP感染BEAS-2B细胞、A549细胞，分别于感染0h、3 h、6 h、12 h、18 h终止感染，吸取细胞培养上清液，用作ELISA法检测SPLUNC1蛋白表达；Trizol裂解细胞，提取细胞总 RNA，用于实时定量逆转录多聚酶链反应（transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测SPLUNC1 mRNA水平。以0h组，即未感染组为对照组。　　3.观察Res对SP感染的BEAS-2B细胞活性影响　　SP感染前24小时加入Res预处理BEAS-2B细胞，根据Res药物浓度不同分为对照组、MOI20 SP组、12.5Res+SP组、25Res+SP组、50Res+SP组（Res浓度分别为0、12.5、25以及50μmol/L），于肺炎链球菌感染0h、3 h、6 h、12 h、18 h后取出细胞，通过CCK8法检测细胞活力。　　4.探讨SPLUNC1的表达及Res的调节机制　　SP(MOI20)感染Res及PDTC预处理的BEAS-2B细胞，于感染后0h、3 h、6 h终止感染，吸取细胞培养上清液，酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测SPLUNC1、白介素-6（interleukin-6， IL-6）以及白介素-8（interleukin-8， IL-8）蛋白水平；加入 Trizol溶液裂解BEAS-2B细胞，提取总的细胞RNA，进行qRT-PCR实验，检测细胞SPLUNC1 mRNA的表达；另一批细胞，相同的处理方式，提取总的细胞蛋白，进行Western Blot实验，对细胞NF-κB蛋白水平进行检测。实验具体分组为：对照组（DMSO）、SP组（SP）、Res组(Res)、Res+SP组(Res+SP)以及PDTC+SP组（PDTC+SP）。　　结果：　　1.奥普托欣实验及SP菌落形态观察　　细菌培养箱孵育18h至24h，呈现灰白色、细小且圆的半透明细菌菌落，其表面光滑、边缘整齐，中心为脐窝状的塌陷，周围可见草绿色溶血环，菌株抑菌环直径＞14mm，提示为SP。　　2.呼吸道上皮细胞形态观察　　未感染的BEAS-2B细胞、A549细胞呈多角形及梭形等不同形态；SP感染后，细胞体积缩小，逐渐稀疏，胞浆增多，核浆比例缩小，常可见空泡以及多个颗粒。　　3.SP感染以时间及浓度依赖的方式损伤呼吸道上皮细胞　　分别用SP感染BEAS-2B细胞及A549细胞，根据感染复数（MOI）不同各自分为MOI0 SP组、MOI20 SP组和MOI50 SP组。结果显示随SP感染时间延长，MOI20 SP组和MOI50 SP组BEAS-2B、A549细胞活性降低，感染24h后由0h时的1左右降至0.53以下，差异显著（P＜0.01）；较SP感染0h相比，MOI50 SP组和MOI20 SP组分别于感染后12h和24h开始出现明显的细胞损伤（P＜0.01），较MOI20 SP组相比，MOI50 SP组提早12个小时出现细胞损伤。　　4.SP诱导呼吸道上皮细胞表达SPLUNC1　　SP（MOI20）感染后，BEAS-2B细胞 SPLUNC1 mRNA高水平表达，3h高达Oh时的2.54，差异具有统计学意义（P＜0.01），6h开始明显下降，低至0h时的1.58倍，且12h、18h仍持续下降，较3h时比较，均差异显著（P＜0.01）；SPLUNC1 mRNA检测在A549细胞中同样表现出了先增高达峰值后下降的变化趋势，但各 SP感染时间点之间差异却并不显著（P＞0.05）。各 SP感染时间点SPLUNC1蛋白分泌情况与SPLUNC1 mRNA表达水平变化相一致。　　5.Res以时间及浓度依赖的方式减轻SP感染对BEAS-2B细胞的损伤　　根据Res药物浓度不同将Res预处理MOI20 SP感染BEAS-2B细胞分为对照组、MOI20 SP组、12.5Res+SP组、25Res+SP组、50Res+SP组。SP感染0h时，较对照组相比，各组细胞间的活性均没有明显的统计学差异（P＞0.05）；较MOI20 SP组相比，感染3 h和6 h时，25 Res+SP组细胞活性明显增强，分别由0.97、0.91增至1.19、1.08，差异具有统计学意义（P＜0.05），但50Res+SP组细胞活性明显下降，感染12 h和18 h时分别由0.91、0.84降至0.65、0.35，差异显著（P＜0.05），而随SP感染时间延长，12.5Res+SP组、25Res+SP组、50Res+SP组细胞活性均呈现明显降低趋势，24h时由0h时的1以上降至0.86以下，差异显著（P＜0.05）。　　6.Res预处理可以增加SP诱导BEAS-2B细胞SPLUNC1的表达　　较对照组相比，SP感染后，SP组SPLUNC1 mRNA呈现高水平表达，3h高达Oh时的2.53，差异具有统计学意义（P＜0.01），6h明显下降，低至0h时的1.53倍，较3h时比较，差异显著（P＜0.01）；较 SP组相比较， Res+SP组SPLUNC1 mRNA表达增加更显著，3h高达Oh时的4.31倍，6h虽明显下降，但仍为0h时的2.65倍，与SP组相比在各感染时间点差异均显著（P＜0.05）；较对照组相比，Res组SPLUNC1 mRNA表达稳定，随时间延长均无明显变化（P＞0.05）。　　7.SP感染后BEAS-2B细胞IL-6、IL-8的表达及Res的干预作用　　较对照组相比，Res组的IL-6、IL-8表达量未见明显改变，差异均不显著（P＞0.05），SP感染后，IL-6、IL-8表达显著增加，分别由78.84、53.48增加至642.7、510.54（pg/ml），差异显著（P＜0.01）；较SP组相比，Res+SP组IL-6、IL-8表达明显减少，仅为422.23、317.64（pg/ml），与SP组差异明显（P＜0.01）。　　8. NF-κB p65在Res调节SP诱导的BEAS-2B细胞表达SPLUNC1中的作用　　较对照组相比，Res组 NF-κB p65蛋白的表达量未见明显改变，差异均不显著（P＞0.05），SP感染后，NF-κB p65表达显著增加，是对照组的1.74倍，差异显著（P＜0.01）；较SP组相比，PDTC+SP组NF-κB p65表达明显减少，仅为对照组的1.24倍，与SP组差异显著（P＜0.01），但SPLUNC1 mRNA表达明显增加，由2.53升至3.77（pg/ml），差异显著（P＜0.05），与此同时， Res+SP组NF-κB p65表达较SP组相比同样减少，但程度不及PDTC+SP组，为对照组的1.44倍，三组间比较差异均显著（P＜0.05）。　　结论：　　1.SP感染以时间及浓度依赖的方式损伤呼吸道上皮细胞，可以诱导 BEAS-2B细胞表达SPLUNC1，SPLUNC1参与BEAS-2B细胞对SP的免疫防御。　　2.Res可以增加SP感染诱导的BEAS-3B细胞SPLUNC1表达，减少IL-6、IL-8的分泌，以时间及浓度依赖的方式减少SP感染对BEAS-3B细胞的损伤。　　3.SPLUNC1的表达与炎性因子 IL-6、IL-8的分泌水平呈负相关，NF-κB参与SP感染后BEAS-2B细胞SPLUNC1的表达，Res对NF-κB表达有下调作用。