H9N2亚型禽流感、新城疫和鸡肝炎-心包积液综合征在我国家禽中均广泛流行且危害严重。作为鸡的三大传染病之一的新城疫是鸡的必防传染病,H9N2亚型禽流感病毒由于抗原性不断变异,现有疫苗免疫效果逐年下降,常常发生免疫失败。鸡肝炎-心包积液综合征是近年来严重危害中国养鸡业的新发传染病,为减少以上三种疫病对我国养鸡业的危害并降低免疫应激,我们开展了 H9N2亚型禽流感、新城疫和鸡肝炎-心包积液综合征三联灭活疫苗的研制。本研究通过病毒遗传进化分析和交叉免疫攻毒保护效果比较,筛选出具有良好交叉免疫保护作用且与流行毒株亲缘关系较近的H9N2亚型禽流感制苗毒株;将该毒株与新城疫病毒和禽腺病毒4型联合制苗,并对其进行疫苗性状和安全性评估;通过抗体效价测定和攻毒保护试验,评估三联疫苗的免疫保护力,确定疫苗最小免疫剂量,以期为三联疫苗的临床应用提供一定的理论依据,具体内容如下:试验一 H9N2亚型禽流感病毒疫苗用毒株的筛选取实验室保存的从江苏省几个发病鸡场和活禽市场分离的5株H9N2亚型禽流感病毒,对其进行HA、NA基因序列分析,结果显示病毒1609JR2#D和1704CZ3-2的HA基因属于分支h9.4.2.1,NA基因属于F/98-like分支,HA和NA基因的核苷酸和氨基酸序列均与近年流行毒株的同源性较低;而病毒18092902、18092904、18092909的HA基因均属于目前中国主要优势流行分支h9.4.2.5,NA基因属于Y280-like分支,HA和NA基因的核苷酸和氨基酸序列均与近年流行毒株的同源性高,提示这3株病毒与近年流行毒株具有较近的亲缘关系。对病毒18092902、18092904和18092909进行灭活并制成相应油乳剂灭活疫苗,经交叉血凝抑制试验和交叉攻毒保护试验,发现由疫苗18092902诱导产生的抗体能与同源病毒和异源病毒产生良好的交叉反应,疫苗18092902免疫鸡对同源病毒和异源病毒的攻击所产生的免疫保护率可达100%,表明18092902病毒株可作为研制H9N2亚型禽流感疫苗的候选毒株。试验二 鸡禽流感（H9N2亚型）、新城疫、鸡肝炎-心包积液综合征三联灭活疫苗的制备和质量检测经鸡胚接种和细胞培养,分别获得病毒含量为108.5 EID50/0.1 mL的18092902株H9N2亚型禽流感病毒、病毒含量为109.17 EID50/0.1 mL的La Sota株新城疫病毒（CVCC AV1615）和病毒含量为105.5 TCID50/0.1 mL的HN株禽腺病毒4型,各病毒液采用最终浓度为0.2%甲醛溶液进行灭活。经灭活检验合格的H9N2禽流感病毒液、新城疫病毒液和禽腺病毒4型病毒液以1:1:1的比例联合制备灭活疫苗。对三联疫苗进行质量评估,物理性状检验和安全性检验结果均为合格。试验三 鸡禽流感（H9N2亚型）、新城疫、鸡肝炎-心包积液综合征三联灭活疫苗的免疫效力测定通过测定疫苗诱导产生的抗体水平和抵御病毒攻击的免疫保护作用,确定鸡禽流感（H9N2亚型）、新城疫、鸡肝炎-心包积液综合征三联灭活疫苗的免疫效果。在疫苗免疫产生期试验中,发现针对H9N2禽流感和新城疫的抗体效价在免疫后0～14 d内出现连续性显著升高（P<0.05）,免疫后21～28 d时抗体产生达到峰值。在疫苗免疫效果试验中,发现三联疫苗免疫鸡能产生抗H9N2禽流感病毒、新城疫病毒和禽腺病毒4型的高水平抗体,能够有效抵御H9N2禽流感病毒和禽腺病毒4型的攻击,免疫保护率达100%,表明研制的三联疫苗具有良好的免疫效力。使用0.1 mL、0.3 mL和0.9mL剂量的疫苗皮下途径免疫鸡来测定疫苗的最小免疫剂量,通过测定抗体水平和攻毒保护率,发现3种免疫剂量所诱导的H9N2禽流感平均抗体效价均达到10.00±0 log2,对H9N2禽流感病毒、禽腺病毒4型的攻毒保护率均达到100%;然而,在新城疫病毒和禽腺病毒4型的抗体诱导产生中出现差异,当免疫剂量为0.1 mL、0.3 mL时,新城疫平均抗体效价和抗禽腺病毒4型平均中和抗体效价均随着剂量增大而显著升高（P<0.01）;当免疫剂量为0.9mL时,新城疫平均抗体效价和抗禽腺病毒4型平均中和抗体效价均无显著变化（P>0.05）,结果表明鸡禽流感（H9N2亚型）、新城疫、鸡肝炎-心包积液综合征三联灭活疫苗的最小免疫剂量为0.1 mL。