第一部分ephrin-B2调节EPC功能在子痫前期发病机制中的作用研究目的探讨ephrin-B2在子痫前期胎盘和血管内皮祖细胞(EPCs)中的表达及其对胎盘血管生成的影响。研究方法1.实验分组:子痫前期组和对照组;提取两组孕妇脐血EPCs及晚孕期胎盘组织;2.采用qRT-PCR及Western Blot检测两组EPCs及胎盘组织中的ephrin-B2表达;3.Ephrin-B2 的调控:①下调ephrin-B2;转染ephrin-B2抑制质粒至EPCs(ephrin-B2抑制组);②上调ephrin-B2:转染ephrin-B2过表达质粒至EPCs(ephrin-B2过表达组);4.了解转染效率:采用qRT-PCR及Western Blot检测各转染组ephrin-B2 mRNA和蛋白水平的表达;5.检测各组转染EPCs的生物学功能:分别采用CCK-8法、Transwell实验、重悬贴壁法测定细胞的活力、迁移能力和分化能力;采用HUVEC小管形成实验分析各组EPCs上清液的促血管形成能力。研究结果1.子痫前期组EPCs和胎盘组织中ephrin-B2的表达均明显高于对照组。2.子痫前期组EPC细胞数量与ephrin-B2的表达水平呈负相关性。3.ephrin-B2抑制组的EPCs中ephrin-B2 mRNA表达和蛋白表达水平降低;过表达组EPCs中ephrin-B2表达则显著升高。4.转染24小时后,ephrin-B2抑制组c的活性升高,已分化的梭形细胞数目以及梭形细胞占细胞总数的比例增加,迁移细胞数目升高,且抑制组上清液培养的HUVEC形成的小管及管腔分支点数增多。5.转染24小时后,ephrin-B2过表达组EPCs的活性、分化能力、迁移能力及促HUVEC形成小管的能力均降低。研究结论子痫前期组EPCs和胎盘组织的ephrin-B2表达明显增加;ephrin-B2可显著抑制EPCs的增殖、迁移、分化和促小管形成能力。据此推测,ephrin-B2可能通过抑制EPC细胞的生物学功能,促进胎盘内皮损伤及子痫前期的发生。第二部分Dll4/Notch信号通路通过调控ephrin-B2对EPC功能的影响研究目的研究EPCs中D114/Notch信号通路对ephrin-B2表达的调控及对EPC功能的影响。研究方法1.激活Dll4/Notch信号通路:使用Notch通路配体sD114刺激EPCs(Dll4组);2.阻断Dll4/Notch信号通路:利用Notch通路抑制剂DAPT培养EPCs(DAPT组);3.了解Dll4/Notch信号通路对ephrin-B2表达的调节:采用qRT-PCR及WesternBlot检测加药处理后各组细胞ephrin-B2 mRNA和蛋白水平的表达;4.检测Dll4/Notch信号通路对EPCs生物学功能的影响:加药处理后24h,分别采用CCK-8法、Transwell实验、重悬贴壁法测定细胞的活力、迁移能力和分化能力;采用HUVEC小管形成实验分析各组EPCs上清液促血管形成能力。研究结果1.D l4/Notch信号通路被激活后,ephrin-B2 mRNA表达和蛋白表达明显升高;EPCs的增殖活性降低;迁移细胞数目减少;已分化的梭形细胞数以及梭形细胞占细胞总数的比例降低;Dll4组上清液培养的HUVEC小管及管腔分支点数减少。2.D l4/Notch信号通路被阻断后,ephrin-B2 mRNA和蛋白表达明显减少;EPC细胞的活力、分化能力、迁移能力和促小管形成能力均显著升高。研究结论激活D114/Notch信号通路可以增加EPCs中ephrin-B2的表达,同时抑制细胞的增殖、迁移、分化和促小管形成能力;阻断Dll4/Notch信号通路则产生相反的效应。研究提示,ephrin-B2作为D114/Notch信号通路的下游基因在EPCs中发挥作用,形成D114/Notch-ephrin-B2 级联通路。第三部分 Dll4/Notch-ephrin-B2级联通路特异性受体Notch4参与调控EPC功能研究目的明确Dll4/Notch-ephrin-B2级联通路在EPCs中的特异性受体及其对EPCs生物学功能的调控。研究方法1.下调Notch1表达:转染Notch1抑制质粒至EPCs(Notch1抑制组);并采用qRT-PCR及Western Blot检测转染细胞Notch1的表达,了解转染效率;2.激活Dll4/Notch信号通路:将sDll4加入Notch1抑制组EPCs中培养24h;3.分析Notch1信号通路对ephrin-B2表达的调节:采用qRT-PCR及Western Blot分别检测加sDll4处理前后Notch1抑制组EPCs中ephrin-B2的表达;4.下调Notch4表达:转染Notch4抑制质粒至EPCs(Notch4抑制组);并采用qRT-PCR及Western Blot检测转染细胞Notch4的表达,了解转染效率;5.激活Dll4/Notch信号通路:将sD114加入Notch4抑制组EPCs中培养24h;6.分析Notch4信号通路对ephrin-B2表达的调节:采用qRT-PCR及Western Blot分别检测加sDll4处理前后Notch4抑制组细胞ephrin-B2的表达;7.检测Notch4信号通路对EPCs生物学功能的影响:转染Notch4抑制质粒24h后,分别采用CCK-8法、Transwell实验、重悬贴壁法测定EPCs的活力、迁移能力和分化能力;采用HUVEC小管形成实验分析各组EPCs上清液的促血管形成能力。研究结果1.Notch4抑制组EPCs中Notch4表达明显降低,ephrin-B2表达也相应降低。2.Notch4抑制后,再用D114激活EPCs的Notch通路,ephrin-B2表达无明显改变。3.Notch1抑制组EPCs中Notch1表达明显降低,但ephrin-B2表达升高。4.Notch1抑制后,再用D114激活EPCs的Notch通路,ephrin-B2表达进一步增加。5.Notch4抑制组的EPCs活性升高;迁移细胞数目增加;已分化的梭形细胞数目及其占比例明显增加;上清液培养的HUVEC小管和管腔分支点数增多。研究结论抑制Nocth4表达可提高EPC细胞的活性,并促进细胞迁移、分化和促小管形成能力。Notch4为Dll4/Notch-ephrin-B2级联通路的特异性受体。第四部分 血管内皮祖细胞移植改善子痫前期大鼠胎盘血管内皮的损伤研究目的将ephrin-B2沉默的EPCs移植到子痫前期大鼠胎盘中,分析移植后孕鼠的血压、妊娠结局和胎盘微血管密度的改变,阐明ephrin-B2对胎盘血管内皮损伤的修复作用。研究方法1.建立子痫前期孕鼠模型:L-NAME腹腔注射法;2.制备移植EPCs:采用密度梯度离心法分离正常大鼠骨髓中EPCs,并将ephriin-B2干扰慢病毒或空载慢病毒转入EPCs中;观察绿色荧光表达、qRT-PCR和Western Blot检测ephrin-B2的转染效率;3.将孕鼠进行如下分组,于孕16天进行胎盘注射/移植,①正常对照组:正常妊娠孕鼠,胎盘注射生理盐水;②子痫前期组:子痫前期孕鼠,胎盘注射生理盐水;③治疗组:子痫前期孕鼠,将转染了 ephrin-B2干扰慢病毒的EPCs注射至胎盘;④治疗对照组:子痫前期孕鼠,将转染了空载慢病毒的EPCs注射至胎盘;4.孕17、19天测量各组孕鼠血压;5.孕20天处死孕鼠,对胎盘组织进行冰冻切片,通过荧光显微镜观察EPCs移植后体内迁移情况;通过qRT-PCR和WesternBlot检查各组胎盘组织ephrin-B2的表达水平;6.比较各组孕鼠妊娠结局和胎盘微血管密度:测量各组胎鼠及胎盘的大小并称重;通过CD34标记的免疫组化测定各组胎盘的微血管密度。研究结果1.本实验选取的28只(每组7只)孕鼠,其中治疗组1只死于术后低体温,其余27只均存活。2.转染干扰慢病毒的EPCs中ephrin-B2mRNA和蛋白表达量明显下降;转染空载慢病毒的EPCs中ephrin-B2表达无明显改变。3.注射EPCs的胎盘组织在荧光显微镜下可见大面积绿色荧光,且荧光沿微血管走形分布。4.孕19天时,治疗组和治疗对照组的血压明显低于子痫前期组;治疗组血压低于治疗对照组。5.治疗组胎盘中ephrin-B2表达水平最低,子痫前期组最高,与其他两个对照组相比均有统计学差异。6.与其它三组相比,子痫前期组的胎盘、胎鼠最小;治疗组与治疗对照组相比,胎鼠重量、胎盘直径和胎盘重量有所增加。7.子痫前期组胎盘的微血管密度明显少于两个对照组和治疗组;治疗组胎盘的微血管数量比治疗对照组多,差异有统计学意义。研究结论EPCs细胞移植可有效地修复子痫前期胎盘的内皮损伤,促进胎盘血管生成,改善孕鼠的血压及妊娠结局;抑制ephrin-B2表达的EPCs移植组比正常EPCs移植组的孕鼠妊娠结局更好,新生的胎盘血管更多,对损伤的内皮修复地更彻底。