五味子叶粗木脂素对CCl4急性肝损伤的保护作用机制及应用研究

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目的以五味子叶为原料,通过醇提法提取并分离纯化粗木脂素,对所得粗木脂素进行定性和定量分析。通过体外抗氧化性实验初步证明其具有抗氧化作用,并进一步通过构建小鼠动物模型阐明其对CCl4急性肝损伤的护肝作用和抗氧化作用。以DPPH自由基清除率为抗氧化性指标,研制一种五味子叶粗木脂素与螺旋藻多糖复配的功能性食品。方法以五味子叶粗木脂素提取率(%)为评价指标,单因素实验优化醇提法在提取五味子叶粗木脂素过程中提取剂、液料比、乙醇浓度、提取p H、提取温度和水浴时间等七个因素的最佳工艺参数。在单因素实验结果基础上,以粗木脂素提取率(%)为响应值,选择三个主要因素:乙醇浓度(%)﹑提取温度(℃)﹑液料比(V:m,m L:g),进行Box-Behnken响应面设计进一步优化五味子叶粗木脂素提取条件。用紫外光谱扫描法初步定性鉴定五味子叶粗提物是否为粗木脂素,运用高效液相色谱法对其进一步定性和定量分析,并计算粗木脂素主要成分如五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子酯甲及总粗木脂素的含量,运用溶剂提取法计算粗木脂素的纯度。以DPPH自由基清除率、·OH自由基清除率和O2-·自由基自由基清除率为参考指标,分析粗木脂素的体外抗氧性。构建CCl4急性肝损伤和五味子叶粗木脂素护肝组的动物模型,以肝组织形态学(H.E.染色切片法)和血清中ALT、AST酶活性(酶标仪法)为肝脏损伤指标,确定肝损伤模型建立是否成功。以小鼠肝脏指数、肝组织中的体内抗氧化酶活性(MDA、SOD、GSH-PX酶)和Ca2+含量为指标阐明五味子叶粗木脂素对肝脏的保护作用。应用Pearson相关系数分析法对以上各个评价指标进行相关性分析,再通过主成分分析法建立线性组合方程。以DPPH自由基清除率为评价指标,运用2×2析因设计分析五味子叶粗木脂素与螺旋藻粗多糖两者之间的正协同相关性。通过单因素实验优化复配比(m螺:m木,g:g)、乙醇浓度(%)、复配p H和超声时间(min)等复配条件。在单因素筛选基础上,以DPPH自由基清除率(%)为响应值,运用Box-Bhnken法优化复配比(m螺:m木,g:g)、乙醇浓度(%)和复配p H三个主要复配因素的最佳参数,最终获得抗氧化性较强的五味子叶粗木脂素和螺旋藻粗多糖的复配功能性食品。结果五味子叶粗木脂素最佳提取工艺条件:按液料比(V:m,m L:g)22:1加入85%乙醇,调p H至6.0,45℃水浴提取20min,再超声30min,五味子叶粗木脂素提取率14.92±0.098%。粗木脂素含有五味子甲素0.01984mg/g、五味子乙素0.00894mg/g、五味子醇甲0.27300mg/g、五味子酯甲0.06740mg/g和粗木脂素0.36651mg/g,粗木脂素纯度为72.58±0.94%。五味子叶粗木脂素的体外抗氧化实验研究结果显示,随着粗木脂素浓度的增加,五味子叶粗木脂素对DPPH自由基清除率、·OH自由基清除率和O2-·自由基清除率也逐渐增加,且具有良好的线性关系。五味子叶粗木脂素对CCl4急性肝损伤的实验结果表明,通过H.E.组织形态学观察,模型组肝组织形态损伤严重;空白组血清中ALT、AST含量显著低于模型组,说明造模成功。粗木脂素处理组的肝体指数、MDA酶和Ca的含量明显低于模型组;粗木脂素处理组的肝组织中的GSH-PX酶、SOD酶明显高于模型组。实验结果说明粗木脂素对于CCl4急性肝损伤具有一定保护作用,且对小鼠肝脏具有抗氧化的作用。Pearson相关性分析结果显示,各个评价指标之间有一定相关性。肝脏指数与GSH-PX酶、肝脏指数与SOD酶呈明显负相关,肝体指数与其余的评价指标之间呈正相关。主成分分析法建立线性方程,其中MDA与肝体指数,AST与ALT之间相关性较高。2×2析因结果显示,粗木脂素和粗多糖具有正协同作用(P<0.01)。最佳复配工艺条件:复配比(m螺:m木,g:g)3:1,40%乙醇浓度,复配p H8.0,超声35min,最佳复配物的DPPH自由基清除率为86.43±0.01%。结论五味子叶粗木脂素的最佳提取率为14.92%,纯度为72.58%。体外抗氧化实验证明其具有抗氧化作用。通过H.E.组织形态学和ALT、AST酶的测定,造模成功。小鼠肝脏指数、肝组织中的体内抗氧化酶活性(MDA、SOD、GSHPX酶)和Ca2+含量为指标,阐明粗木脂素对于CCl4急性肝损伤具有一定保护作用,且对小鼠肝脏具有抗氧化的作用。基于其抗氧化特性,研制一种五味子叶粗木脂素与螺旋藻多糖复配的功能性食品。
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