原发性或者继发性癌症疼痛是最严重的疼痛之一。70%的乳腺癌及前列腺癌肿瘤患者存在骨转移,在因乳腺癌和前列腺癌死去的病例中,这一数字高达90%。临床上,转移性骨肿瘤常导致局部剧烈疼痛、病理性骨折、脊髓压迫等神经症状和威胁生命的高钙血症等症状,严重影响患者的生存质量。随着癌症诊疗技术的不断发展和进步,癌症病人的生存时间不断延长,提高癌症病人的生存质量显得尤为重要。虽然有WHO倡导的镇痛三阶梯疗法取得了一定的成效,仍有一部分患者的疼痛得不到有效缓解,对骨癌痛的治疗还存在局限性。近年来出现的骨癌痛动物模型为骨癌痛的机制研究提供了新思路和理论依据,也为开发新的治疗骨癌痛的药物奠定了基础。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,能够将胞外刺激信号转导成胞内的转录和翻译后效应。MAPK家族包括胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)。研究证明,在炎症痛和神经痛过程中,脊髓MAPK三条信号通路存在不同程度的激活,抑制MAPK信号通路可以减轻痛觉超敏,提示MAPK信号通路参与了炎症痛和神经痛的中枢敏化过程。那么,在骨癌痛过程中,MAPK信号通路是否参与了骨癌痛的发生发展过程?在不同时程都有哪些不同的变化?这些问题成为本论文的研究重点。作为中华民族的宝贵财富,目前中医药在世界范围内受到了越来越多的关注。水蛭是我国传统中药中常用的活血化瘀药,味咸、苦,性平、有毒。归肝经、膀胱经。具有活血、散瘀、通经的功能,用治蓄血、癥痂、积聚、经闭,跌打肿痛等症。水蛭素是水蛭中的主要活性成分。有实验表明,水蛭素具有镇痛作用,可以缓解神经痛过程中的痛觉超敏,其作用机制可能为水蛭素结合凝血酶后,抑制凝血酶与其受体结合导致血小板源性生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)释放减少,从而发挥镇痛作用。中医对癌症的认识由来已久,按照癌瘤发生的不同部位将其分为“筋癌、肠癌、骨癌”等。癌症的病因主要有阴阳失调、正气不足、饮食因素和情志不畅等。对癌症的治疗也主要以活血化瘀、补益气血为主。癌痛病机分为虚实两类,包括不通则痛和不荣则痛。但就临床实际来看,癌痛病机多见虚实错杂。那么,水蛭素是否可以减轻骨癌痛,其缓解骨癌痛的机制如何成为本论文研究的第二个方面。综上所述,本论文拟在骨癌痛模型上,采用行为学、分子生物学等技术开展以下研究：(1)观察骨癌痛动物模型12天脊髓背角胶质细胞变化以及胶质细胞抑制剂对骨癌痛痛觉超敏的影响；(2)观察骨癌痛过程中不同时程脊髓MAPK信号通路的变化,探讨三条MAPK信号通路在骨癌痛过程中的作用；(3)观察水蛭素对骨癌痛行为的影响及探讨其缓解骨癌痛的机制。实验结果如下：1.大鼠胫骨髓腔接种Walker256乳腺癌细胞引起机械性痛觉超敏将大鼠随机分为两组,正常组(Normal)和模型组(Model),每组10只。模型大鼠胫骨内注射4×105个Walker256乳腺癌细胞造成胫骨癌痛模型,从术后第4天开始,前三周隔日测量患侧及对侧后肢的机械性痛阈值(paw withdrawal threshold, PWT),最后一周隔三天测量其PWT,持续至造模后第27天。结果表明,骨癌痛大鼠与正常大鼠相比,双侧后肢机械性痛阈降低,出现明显的痛觉超敏现象。小结：模型大鼠出现双侧后肢机械性痛阈降低的现象,证实骨癌痛大鼠模型成功。2.骨癌痛模型脊髓背角胶质细胞的变化及作用2.1星形胶质细胞在骨癌痛过程中的变化及作用将大鼠随机分为两组,正常组(Normal)和模型12天组(Day12)。采用荧光免疫组织化学染色的方法观察脊髓背角L4-L5节段星形胶质细胞标记物GFAP的表达变化。结果显示与正常组相比模型12天组GFAP标记的星形胶质细胞有明显激活,表现为增生肥大。行为学实验中将模型大鼠随机分为两组,模型+生理盐水组(saline)和模型+fluorocirrate(FC)组,每组10只。结果显示单次鞘内注射星形胶质细胞的抑制剂FC lnmo1/只可以减轻模型大鼠双侧后肢的机械性痛觉超敏,具有明显的镇痛作用。2.2小胶质细胞在骨癌痛过程中的变化和作用将大鼠随机分为两组,正常组(Normal)和模型12天组(Day12)。采用荧光免疫组织化学染色的方法观察脊髓背角L4-L5节段小胶质细胞标记物CDllb的表达变化。结果显示,与正常组相比模型12天组CD11b标记的小胶质细胞有明显激活,表现为增生肥大。行为学实验第一部分将模型大鼠随机分为两组,模型+生理盐水组(saline)和模型+米诺环素(minocycline)组,每组10只。结果显示单次鞘内注射小胶质细胞的抑制剂米诺环素100μg/只可以减轻模型大鼠双侧后肢的机械性痛觉超敏,具有明显的镇痛作用。行为学实验第二部分将大鼠随机分为正常组(Normal)、模型+生理盐水组(Model+saline)、模型+20mg/kg米诺环素组(Model+20mg/kg minocycline)、模型+50mg/kg米诺环素组(Model+50mg/kg minocycline)和模型+100mg/kg米诺环素组(Model+100mgkg minocycline),每组12只。结果显示灌胃给予三个剂量的米诺环素对骨癌痛大鼠的机械性痛觉超敏都没有显著镇痛作用。小结：骨癌痛模型12天双侧脊髓背角L4-L5节段星形胶质细胞和小胶质细胞被激活,且单次鞘内注射星形胶质细胞抑制剂FC可以提高模型大鼠的机械性痛阈：单次鞘内注射小胶质细胞的抑制剂米诺环素可以减轻模型大鼠的机械性痛觉超敏,但多次灌胃给予米诺环素对骨癌痛大鼠的痛阈没有明显影响。3.脊髓背角MAPK信号通路在骨癌痛时的变化和作用3.1脊髓背角ERK在骨癌痛时的变化和作用采用Western blot和免疫荧光双标的方法观察磷酸化ERK(pERK)在模型5天、12天和16天的变化。将大鼠随机分为正常组(Normal)、模型5天组(Day5)、模型12天组(Day12)和模型16天组(Day16)。Western blot结果显示,pERK在模型双侧脊髓背角L4-L5节段各个时间点均有增加,免疫荧光双标的结果显示增加的pERK主要存在于星形胶质细胞和小胶质细胞中。行为学实验分为两个部分,第一部分将模型大鼠随机分为20%DMS0组(20%DMSO)和给药组(PD9805910μg/只),每组6只。结果显示,模型12天单次鞘内注射MEK抑制剂(ERK上游激酶)PD98059可以提高模型大鼠双侧后肢的机械性痛阈。行为学第二个部分将模型大鼠随机分为10%DMSO组(10%DMS0)、低剂量给药组(U01261.251μg/只)和高剂量给药组(U01263μg/只),每组8只。结果显示,模型14天单次鞘内给予两个剂量的MEK抑制剂(ERK上游激酶)U0126可以减轻模型大鼠的机械性痛觉超敏现象。DMSO对骨癌痛大鼠的痛阈没有影响。3.2脊髓背角JNK在骨癌痛时的变化和作用采用Western blot和免疫荧光双标的方法观察磷酸化JNK(pJNK)在模型5天、12天和16天的变化。将大鼠随机分为正常组(Normal)、模型5天组(Day5)、模型12天组(Day12)和模型16天组(Dayl6)。Western blot结果显示,pJNK在模型双侧脊髓背角各个时间点均有增加,免疫荧光双标的结果显示增加的pJNK主要存在于星形胶质细胞和神经元中。行为学实验分为两个部分,将模型大鼠随机分为30%DMS0组(30%DMS0)和给药组(JNK抑制剂SP60012510μg/只),每组6只。结果显示,模型12天单次鞘内注射SP600125可以提高模型大鼠双侧后肢的机械性痛阈,12小时镇痛作用消失。行为学第二个部分,分组同上,从模型10天开始,采用多次鞘内注射的方法,每日鞘内注射SP60012610μg/只,连续三天后SP600126的镇痛作用可以持续至给药后12小时；连续给药5天后,SP600126的镇痛作用可以持续至给药后24小时。DMSO对骨癌痛大鼠的痛阈没有影响。3.3脊髓背角p38在骨癌痛中的作用将大鼠随机分为正常组(Normal)、模型+5%DMSO组(Model+5%DMSO)、模型+SB203580(p38抑制剂)1μg/只组(Model+SB2035801μg)、模型+SB2035805μg/只组(Model+SB2035805μg)和模型+SB20358010μg/只组(Model+SB20358010μg)组,每组8只。采用鞘内置管的方法,从造模后第一天即开始给予p38的抑制剂SB203580,每日一次,连续12天。结果发现,10μg剂量的SB203580可以抑制骨癌痛大鼠痛觉超敏的形成和发展。5μg剂量的SB203580可以提高模型大鼠的机械性痛阈,1μg剂量的SB203580对骨癌痛大鼠的痛阈没有影响。DMSO对骨癌痛大鼠的痛阈没有影响。小结：脊髓ERK和JNK信号通路在骨癌痛发展过程中有不同程度的激活。增加的pERK主要存在于小胶质细胞和星形胶质细胞中,单次鞘内注射MEK(ERK上游激酶)的抑制剂PD98059和U0126都可以减轻模型大鼠的机械性痛觉超敏现象。增加的pJNK主要存在于神经元和星形胶质细胞中,单次鞘内注射JNK的抑制剂SP600125可以明显提高模型大鼠双侧后肢的机械性痛阈,且多次注射SP600125可以产生累加镇痛作用。采用鞘内置管的方式造模后连续多次给予p38的抑制剂SB203580共12天,可以抑制骨癌痛的形成和发展。4.水蛭素对骨癌痛大鼠痛阈的影响及其机制4.1水蛭素对骨癌痛大鼠痛阈的影响行为学实验分为两个部分。首先采用静脉给药的方式观察疏血通注射液对骨癌痛的影响,疏血通注射液的主要成分为水蛭素。将大鼠随机分为正常组(Normal)、模型组(Model)、模型+生理盐水组(Saline)和模型十疏血通给药组(疏血通),每组12只。结果显示,模型12天尾静脉给予疏血通注射液可以产生镇痛作用,给药后2小时镇痛作用达到最大,给药后4小时镇痛作用消失。行为学第二个部分采用鞘内注射的方式观察单体水蛭素对骨癌痛行为的影响。将模型大鼠随机分为生理盐水组(Saline)、50pmol水蛭素组(50pmol hirudin)100pmol水蛭素组(100pmol hirudin)和200pmol水蛭素组(200pmol hirudin),每组8只。结果显示,水蛭素各个剂量均可以产生镇痛作用,且呈剂量依赖性。给药后2小时镇痛作用达到最大,给药后4小时镇痛作用消失。而给予正常大鼠单次鞘内注射200pmol水蛭素对其痛阈没有影响。4.2凝血酶受体1(PAR1)在脊髓背角的表达与分布将大鼠随机分为正常组(Normal)、模型5天组(Day5)、模型12天组(Day12)和模型16天组(Day16),每组4只。采用荧光免疫组织化学染色的方法观察PAR1在大鼠脊髓背角的表达。结果显示,脊髓背角L4-L5节段存在明显的PAR1阳性细胞。采用RT-PCR的方法观察到与正常组相比PAR1mRNA在模型12天和模型16天表达显著减少。免疫荧光双标结果显示,模型12天PAR1与pERK. pJNK在脊髓背角有共存现象。4.3单次鞘内注射水蛭素对脊髓MAPK信号通路的影响将大鼠分为正常组(Normal)、模型+生理盐水组(Model+saline)和模型+100pmol水蛭素组(Model+100pmol hirudin),每组4只。采用Western blot的方法观察单次鞘内给予水蛭素2小时后脊髓背角ERK、JNK信号通路的变化。结果显示,与生理盐水对照组相比,单次鞘内注射水蛭素可以降低模型中(?)JNK2的表达水平,对ERK信号通路没有明显影响。小结：静脉及鞘内给予水蛭素可以减轻骨癌痛大鼠双侧的机械性痛觉超敏。鞘内给药后2小时,l00pmol的水蛭素可以减少模型PJNK2的表达,对模型中ERK磷酸化水平没有明显影响。凝血酶受体1(PAR1)表达于大鼠脊髓背角,且与ERK、JNK信号通路有共存现象。综上所述,本工作提示：1.脊髓背角L4-L5节段星形胶质细胞和小胶质细胞在骨癌痛大鼠模型12天存在激活,使用星形胶质细胞和小胶质细胞的抑制剂可以减轻骨癌痛,提示星形胶质细胞和小胶质细胞均参与了骨癌痛大鼠痛觉超敏过程。2.骨癌痛过程中,脊髓背角ERK和JNK信号通路主要在胶质细胞中被激活,鞘内注射MAPK信号通路的三种抑制剂均可以减轻骨癌痛大鼠的机械性痛敏,提示脊髓胶质细胞MAPK信号通路参与了骨癌痛过程。3.静脉及鞘内给予水蛭素可以提高骨癌痛大鼠的机械性痛阈,鞘内注射水蛭素后2小时可以减少脊髓背角PJNK2的表达,且脊髓背角凝血酶受体1(PAR1)与pJNK有共存,提示水蛭素可能通过结合凝血酶,影响凝血酶激活PAR1从而减少JNK2的磷酸化达到镇痛的作用。