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高糖通过环氧化酶2依赖性途径诱导血管内皮细胞内质网应激背景心血管并发症被认为是糖尿病患者的主要死亡原因之一。大量的临床和实验室研究证实,血糖增高引起的血管内皮代谢紊乱和形态异常是糖尿病血管损伤的关键。实验证实了高糖可以诱发血管内皮细胞发生凋亡,但是其作用机制尚不明确。内质网(endoplasmicreticulum,ER)途径是近年来发现的一条细胞内凋亡途径。内质网稳态的破坏能够影响蛋白质的折叠,从而引起非折叠蛋白应答(unfolded protein response,UPR)或称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)。化学毒素,氧化应激与/或内质网中错误折叠蛋白的积累都会破坏内质网功能,导致内质网应激的发生。高糖诱导的线粒体活性氧释放增加是导致糖尿病血管并发症发生发展的主要因素。所以,我们推测内质网应激途径亦可能参与了高糖诱导的血管内皮细胞的凋亡过程。近年来,血糖增高诱发的炎症被认为是糖尿病心血管病变的另一主要机制。有证据均提示,内皮源性的COX-2可能是糖尿病介导血管炎性反应的重要递质,但COX-2是否亦参与了高糖诱导的血管内皮细胞的内质网应激途径还有待于进一步证明。目的本实验将主要观察高糖对血管内皮细胞内质网应激途径中标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的影响,并阐明COX-2在其中的作用。方法(1)人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分别用含5.5mmol/L与30mmol/L葡萄糖的DMEM培养基进行处理24、36和48 h。(2)细胞活性用MTT法来测定。(3)细胞凋亡用PI染色流式细胞术来确定。(4)COX-2,GRP78和CHOP的表达情况用Western Blotting来确定。结果高糖对HUVECs细胞存活率的影响分别用含正常糖(5.5mmol/L)和高糖(30mmol/L)的DMEM培养基孵育HUVECs细胞24,36或48 h后,用MTT法检测细胞存活率。结果显示,高糖孵育24 h对细胞存活率无明显影响。然而,高糖孵育36～48 h后,高糖组的OD值明显低于相应对照组(P＜0.01)与相应对照组相比,甘露醇处理对细胞存活率无明显影响。高糖对HUVECs细胞GRP78和CHOP蛋白表达的影响Western Blotting结果显示,与相同孵育时间的正常糖对照组相比,HUVECs细胞经高糖孵育24～36 h后,GRP78蛋白表达量增高(P＜0.01);但细胞经高糖孵育48 h后,GRP78蛋白表达量反而减少(P＜0.05)。HUVECs细胞经高糖孵育24 h后,对CHOP蛋白的表达量无明显影响,但对细胞经高糖孵育36～48 h后,CHOP蛋白的表达量明显增加(P＜0.01)。甘露醇对GRP78和CHOP蛋白表达量均无明显影响。高糖对HUVECs细胞COX-2蛋白表达的影响Western Blotting结果显示,与相同孵育时间的正常糖对照组相比,HUVECs细胞经高糖孵育24～48 h后,COX-2蛋白表达量逐渐增高(P＜0.01),并呈现时间依从性。甘露醇对HUVECs细胞COX-2蛋白表达量无明显影响。COX-2抑制剂尼美舒利对GRP-78和CHOP蛋白表达的影响Western Blotting结果显示,与正常糖组对照相比,HUVECs细胞经高糖孵育48 h后,GRP78蛋白表达减少而CHOP蛋白表达增加;然而,经尼美舒利与高糖共孵育后,可明显抑制高糖引起的GRP78蛋白表达减少,以及CHOP蛋白表达增加(P＜0.05)。单纯尼美舒利对HUVECs细胞GRP78和CHOP蛋白表达均明显影响。尼美舒利对高糖诱导的细胞生存率下降和细胞凋亡的影响与正常糖对照组相比,用含高糖的DMEM培养基孵育HUVECs细胞48 h后,细胞生存率下降,细胞凋亡增加。尼美舒利对高糖诱导的细胞生存率下降和细胞凋亡有显著抑制作用。单纯尼美舒利对HUVECs细胞生存率和细胞凋亡均无明显影响。结论高糖孵育48 h后,细胞存活率明显下降,凋亡细胞数则增加。其机制可能与高糖引起的GRP78蛋白的表达下降和CHOP蛋白表达上调有关,且高糖诱导的内质网应激依赖于COX-2蛋白的上调。