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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征的病原，此病以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统症状为特征。是世界养猪业的一个巨大的威胁。近年来，此病给各国养猪业造成了巨大的经济损失。此病毒分为两个基因型，Ⅰ型（欧洲型）和Ⅱ型（北美型）。关于PRRSV基因组RNA的复制、亚基因组mRNA的合成和蛋白翻译、病毒颗粒组装以及病毒致病机理等许多问题目前正待解决。目前，大量研究已经证明，PRRSV基因组的5'非编码区(5'UTR)对病毒复制至关重要，但是目前对其存在的顺式作用元件和调控功能还知之甚少。本研究基于实验室构建的Ⅱ型PRRSV全长感染性克隆，构建了一系列5'UTR5'端缺失突变体以及两型UTR互换的突变体，通过RNA/DNA转染、病毒拯救、病毒学分析等，初步解析了的PRRSV5'UTR一些顺式作用元件的结构与功能，对进一步剖析病毒致病机理有重要意义。现将研究内容简述如下:
1.猪繁殖与呼吸综合征病毒5'非翻译区存在与病毒感染性相关的顺式调控元件本研究基于北美型（Ⅱ型）PRRSV弱毒株感染性克隆pAPRRS的骨架，构建了一系列在5'UTR5'端缺失的突变全长克隆，通过体外转录的RNA转染和直接DNA转染，病毒拯救及后续病毒学检测，结果显示:PRRSV5'UTR的5'端前3个碱基可以缺失，对病毒的感染性基本无影响;5'端前16个碱基的保守性对病毒非必需，但是拯救的病毒随着碱基缺失的增多，复制的第一轮病毒在MARC-145细胞上的滴度明显降低，其后随着突变病毒在MARC-145细胞上传代，其复制效率得到一定程度的恢复，但降低的趋势未改变。缺失突变病毒的5'端被一系列AU-rich的序列来修复。后续对5'UTR进行的二级结构预测分析发现，外源序列使得SL1得以修复，综上所述，病毒5'端前16个碱基的保守性对病毒复制是非必须的，其所形成的SL1对病毒的感染性至关重要。
2.5'UTR5'端序列缺失体外源序列修复分析为了进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因组5'非翻译区的结构与功能，本研究利用上述5'UTR5'末端缺失的突变体病毒，利用5'RACE技术对突变病毒的5'末端进行测序分析。在研究过程中发现，拯救病毒5'末端的突变位点能被一些未知来源的AU-rich外源序列所修复。鉴于T7启动子与CMV启动子转录起始位点有所不同，我们人为引入一段GC-rich的序列以判断上述修复过程是否为模板依赖性。结果证明，病毒的外源序列修复机制是非模板依赖性的。通过二级结构预测分析发现，在PRRSV5'UTR中的第一个茎环结构(SL1)是病毒感染性必不可少的。
3.基于Ⅱ型PRRSV基因组骨架，Ⅰ型5'UTR在功能上可以完全替代Ⅱ型的5'UTR发挥作用本研究将欧洲型PRRSV5'UTR替换入北美型PRRSV弱毒株感染性克隆pAPRRS的骨架中，构建pAPLV5。经过DNA转染入MARC-145细胞系中，经过两次传代，拯救出嵌合病毒vAPLV5。嵌合病毒与亲本病毒进行病毒学分析比较发现，在病毒复制、空斑形态、基因组负链复制和亚基因组转录等层面，嵌合病毒与亲本毒差异不显著。Ⅰ型5'UTR在功能上可完全替代Ⅱ型的5'UTR。
4.异源5'非翻译区在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性拯救过程中的功能解析为了进一步分析Ⅰ型5'UTR是如何在Ⅱ型PRRSV骨架上发挥作用的，通过对嵌合病毒的全长测序发现，嵌合病毒基因组较亲本病毒发生了碱基突变，突变主要集中于Nsp2和Nsp9位置。我们将可能与5'UTR发挥调控作用相关的Nsp9位置（病毒的RNA依赖的RNA聚合酶，RdRp）的四处突变位点引入嵌合病毒的感染性克隆pAPLV5，所构建的四个突变嵌合克隆转染MARC-145细胞后无需传代即产生细胞病变(CPE)。且病毒滴度较原嵌合病毒vAPLV5高，病毒空斑形态较vAPLV5小。通过半定量负链和亚基因组检测发现，突变嵌合病毒的RNA合成水平也较亲本嵌合病毒高。由此可见病毒5'UTR发挥作用是与RdRp密切相关的，异源的5'UTR通过突变的RdRp共同作用完成病毒的拯救过程，发挥其调控作用。
本研究第一次报道了PRRSVⅠ型5'UTR在Ⅱ型基因组骨架上能完全发挥调控作用，在功能上是可以替换的。另外对5'UTR5'端外源修复序列的来源问题进行了探索，发现病毒的修复过程并不是模板依赖性的，综上所述，本研究针对PRRSV5'UTR的一级序列及可能的顺式作用元件进行解析，为进一步剖析PRRSV5'UTR的结构与功能的关系，及研发基因工程标识疫苗奠定了基础。