【摘 要】
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为快速确诊由猪链球菌（SS）、胸膜肺炎放线杆菌（APP）、多杀性巴氏杆菌（Pm）、副猪嗜血杆菌（HPS）、支气管败血波氏杆菌（Bb）和猪肺炎支原体（Mhp）单独或混合感染引起的猪呼吸道疾病,调查贵州省猪呼吸道病原菌的流行情况,本研究针对APP ApxⅣA基因、Pm KMT1基因、SS gdh基因、HPS 16S r RNA基因和Mhp P36 ldh基因的基因序列,分别设计合成了特异性引物,同时B
【基金项目】
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贵州省科技计划项目:猪呼吸道疾病综合征多重PCR的建立及防治研究（黔科合支撑[2019]2276 号）； 贵州省科技计划项目:水芋香猪绿色养殖关键技术研究及示范（黔科合支撑[2020]1Y033号）；
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为快速确诊由猪链球菌（SS）、胸膜肺炎放线杆菌（APP）、多杀性巴氏杆菌（Pm）、副猪嗜血杆菌（HPS）、支气管败血波氏杆菌（Bb）和猪肺炎支原体（Mhp）单独或混合感染引起的猪呼吸道疾病,调查贵州省猪呼吸道病原菌的流行情况,本研究针对APP ApxⅣA基因、Pm KMT1基因、SS gdh基因、HPS 16S r RNA基因和Mhp P36 ldh基因的基因序列,分别设计合成了特异性引物,同时Bb fla基因的引物合成参考文献中的引物序列。优化单一和多重PCR反应体系和反应条件,建立及检测单一和多重PCR检测方法的特异性、敏感性和重复性。并且,利用建立的六重PCR和单一PCR检测方法对2020年10月至2021年3月贵州省9个市（州）部分猪场的25份发病猪鼻拭子、14份发病猪肺脏组织病料和430份表观健康猪鼻拭子进行检测。研究结果如下:1.成功建立能够用于快速诊断细菌性猪呼吸道疾病的APP、Pm、SS、HPS、Bb和Mhp的单一PCR检测方法,且单一PCR最佳引物浓度分别为0.6μmo L·L-1、0.4μmo L·L-1、0.4μmo L·L-1、0.4μmo L·L-1、0.6μmo L·L-1、0.4μmo L·L-1,最佳退火温度为62℃,最低核酸检测量分别为:APP 0.07 pg,Pm 0.044 pg、SS 3.06 pg、HPS 1.90 pg、Bb 4.44 pg、Mhp 6.14 pg;特异性好,仅扩增出APP、Pm、SS、HPS、Bb和Mhp的特异性目的基因片段。2.成功建立APP和HPS二重PCR检测方法,APP、SS和HPS三重PCR检测方法,APP、SS、HPS和Bb四重PCR检测方法,APP、Pm、SS、HPS和Bb五重PCR检测方法,特异性、敏感性和重复性均较好。成功建立APP、Pm、SS、HPS、Bb和Mhp的六重PCR检测方法,六重PCR最佳引物浓度为:apxⅣA-F/R 1.0μmo L·L-1,KMT1-F/R 0.2μmo L·L-1、gdh-F/R 0.2μmo L·L-1、16S r RNA-F/R 0.2μmo L·L-1、p36 ldh-F/R 0.2μmo L·L-1和fla-F/R 0.4μmo L·L-1,最佳退火温度为62℃,最低核酸检测量为:APP 26.25 pg,Pm 2.19 pg,SS 2.0 pg,HPS 2.22 pg,Mhp 3.07 pg,Bb 4.3 pg,并且特异性和重复性均较好。建立的六重PCR检测方法用于临床样品的检测时,与单一PCR检测方法检出的阳性数符合率较高,为96.76%。3.2020年10月至2021年3月,猪呼吸道病原菌在贵州省部分猪场的流行以SS和HPS为主,且主要以SS+HPS二重感染为主,其他感染类型检出率较高的为SS、Pm+SS+HPS和HPS,五重感染仅在表观健康猪鼻拭子中检测到,APP主要在发病猪肺脏中检出。并且,从采自2020年10月至2021年3月9个市（州）部分猪场的样品中检测到病原菌感染类型最多的是六盘水市,其次是铜仁市和黔东南州,贵阳市最少。除了遵义市、黔西南州和黔东南州,其他6个市（州）的部分猪场的猪主要是SS+HPS的二重感染,黔东南州的部分猪场主要是SS感染。
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