参量宽带四波混频CARS光谱成像技术研究

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相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering,CARS)显微成像技术,由于对分子本源化学键成像具有非标记成像的优势;由于CARS属于三阶非线性效应,具有较高的空间分辨率与三维层析能力。但是,截至目前,如何快速稳定的测量宽带CARS成像系统的一个重要参数——横向空间分辨率,仍是一个亟待解决的问题。对于传统的单频CARS成像系统而言,通常采用聚苯乙烯微球针对特殊的化学键成像来测量出CARS成像系统的横向空间分辨率,但是宽带CARS光谱显微成像需要把激发光的能量分配到各个化学键,所以宽带CARS所需的光功率相对单频CARS而言要高出许多;另外,由于使用光谱仪而不是光电倍增管进行信号测量,所需曝光时间相对较长。因此较长的曝光时间与较高的光功率共同考验聚苯乙烯样品的光功率耐受度(忍受高功率的同时,保持原有形态的能力)。通常情况下所使用的聚苯乙烯样品尺寸越大,所能承受的光功率亦会越高。测量系统的图像一般是样品尺寸与系统的点扩展函数之间的卷积,比如所有的荧光成像。但是对于CARS成像系统而言,当样品尺寸比系统点扩展函数稍大时,实际测量所得样品的图像却不是样品尺寸与系统的点扩展函数之间的卷积。由于双光子荧光与CARS同属于三阶非线性效应,理论计算公式亦表明,影响两种方法的分辨率计算精度的因素是一样的:当激发光波长相同的时候,影响分辨率差异的因素主要是分母里的非线性效应的阶数,所以通过测量双光子荧光图像来获得系统的横向空间分辨率来表示CARS系统的分辨率也是可行的。对于宽带四波混频CARS成像系统分辨率的测量,虽然可以使用双光子荧光图像标定宽带CARS成像系统的分辨率,但是当激发光波长变短时,实验室现有符合要求材料的极少且定制费用高。因此对功率较高及曝光时间长的宽带CARS进行成像时,为了快速稳定的获取系统分辨率并且不影响系统的稳定性和不增加系统的调节复杂度,就必须从深层的非线性四波混频机制来研究CARS过程,进而寻找出快速稳定获取宽带CARS光谱成像系统空间分辨率的新途径。研究结果表明,使用双光子荧光图像去卷积的方式可以快速获取宽带CARS成像系统的横向空间分辨率;对于小尺寸、功率耐受较高材料进行非线性四波混频信号成像并采用高斯去卷积的方式也可以快速获得CARS成像系统的横向空间分辨率。本论文的主要研究工作包括以下几个方面:1、针对如何快速有效地测量宽带CARS成像系统的横向空间分辨率,本文从能级的角度出发,采用半经典理论分析一般的四波混频过程的方法,并通过类比的方式清晰的给出了非线性四波混频信号产生的内在机制,证明CARS只是四波混频的一种特殊情况,在四波混频信号的理论的指导下,帮助实验打破了测量宽带CARS成像系统分辨率选材的局限性。2、先从理论上给出了同属三阶非线性效应的双光子荧光与CARS信号的表达式形式,并进行了数值拟合,数值拟合的数据与文献中的结果进行对比,揭示了造成这两种非线性效应成像之间差异的根本原因。3、对抽象的宽带CARS理论进行数值分析,直观地给出了造成不同峰值信号强度之间差异的原因,然后,在宽带CARS成像系统上开展生物学应用,并使用最大熵光谱分析方法处理宽带CARS图像数据,得到了与宽带CARS图像对应的拉曼图像。4、本论文采用自建动态分析模型,系统分析了熔融石英珠样品,利用轴上光线与球心之间的相对位移,结合参量四波混频理论,从1.01μm聚苯乙烯荧光珠成像实验上深入分析了造成相对大尺寸有结构样品的四波混频成像图像的横向尺寸小于实际样品尺寸的原因。解析结果与实验结果相结合,给出四波混频图像大小有关的定量解析角度26.88°。5、在自行研制的宽带CARS光谱成像仪器上,开展了基于有机样品二甲基亚砜与苯甲腈的光谱实验分析了4000 cm-1以内4000 cm-1以外的宽带四波混频信号之间的关系;采用聚苯乙烯荧光珠及纯的聚苯乙烯珠开展间接测量及直接的传统方法测量宽带CARS系统的横向空间分辨率;基于非线性四波混频信号产生的机制,使用SiO2小球直接测量CARS成像系统横向空间分辨率,并获得了369.6 nm的分辨率。本论文的主要创新点1、通过双光子荧光成像的图像间接测量宽带CARS成像系统的横向空间分辨率。2、利用自建动态模型数值分析了大直径石英珠,得到了非线性四波混频图像横向尺寸比实际样品尺寸偏小的原因——相位匹配条件。3、采用半经典理论分析了参量四波混频信号产生的内在机制,拓展了选取的耐高温材料范围,使用耐高温SiO2材料的四波混频非共振信号直接测量CARS显微成像系统的横向空间分辨率。使用耐高温材料的优点是降低了系统的调节复杂度,节约了逐步优化所需消耗的时间,增加了实验测试的可重复性与系统的稳定性。
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