论文部分内容阅读
目的体外构建靶向软骨的携带绿色荧光蛋白的壳聚糖基因传递系统(lowmolecular weight chitosan/nhanced green fluorescent protein LMWC/EGFP);初步探讨LMWC/EGFP基因纳米复合物诱导软骨细胞向缺损软骨表面靶向聚集是否与电荷呈相关性的机制,并观察其在家兔膝关节软骨缺损模型中促进软骨修复的作用。方法制备TGF-β1/LMWC DNA纳米微粒组、TGF-β1/PEI DNA纳米微粒组、对家兔膝关节的软骨细胞进行体外转染操作,借助酶联免疫吸附试验的方式(ELISA)检测0h,1h,6h,1d,2d,3d,5d,7d培养液中生长因子hTGF-β1的含量,以观察该支架的缓释作用;制备家兔膝关节软骨缺损模型,制备TGF-β1/LMWC DNA纳米微粒组作为实验组,TGF-β1/PEI DNA纳米微粒组作为阳性对照组,TGF-β1/裸质粒复合物作为空白对照组,分别携带绿色荧光蛋白,将三组复合物分别植入家兔软骨缺损处,转染缺损处软骨细胞,2月后处死,取膝关节软骨组织行组织病理切片,荧光显微镜观察和II型胶原免疫荧光染色观察复合物聚集现象和软骨细胞生长情况。结果体外转染软骨细胞后实验组和阳性对照组复合物细胞培养液中随着时间的延长TGF-β1浓度逐渐降低,但相应时间点实验组TGF-β1浓度明显高于阳性对照组,说明LMWC基因载体对hTGF-β1有一定的缓释作用;GF-β1/LMWC DNA纳米微粒组,TGF-β1/PEI DNA纳米微粒组,TGF-β1/裸质粒复合物三组复合物转染家兔膝关节软骨缺损后2个月,发现TGF-β1/LMWC DNA纳米微粒组病理切片中软骨细胞和复合物在缺损软骨表面聚集程度明显高于对照组,且TGF-β1/LMWC DNA纳米微粒组荧光倒置显微镜下软骨细胞聚集程度明显高于对照组,免疫荧光显示实验组II型胶原数量也多余其他两组,说明被试验的软骨细胞形成状况显著优于另外两组,这一差别在统计学层面具有价值,即p<0.05。结论TGF-β1/LMWC DNA纳米微粒复合物在体外和体内均可有效诱导软骨细胞生长,且因/LMWC DNA纳米微粒复合物组较TGF-β1/PEI DNA纳米微粒组在兔关节软骨缺损处聚集现象明显增多,故考虑此聚集现象呈电荷相关性。同时,该支架对TGF-β1有一定的缓释作用,可用于修复膝关节软骨缺损。