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目的:为寻求高效的HCV/HBV联合基因免疫策略,研究免疫刺激DNA序列联合 基因免疫在Balb/C小鼠的免疫应答及在HBV转基因鼠的抗病毒效应。材料与方法: 1.分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于含两套表达单元的真核双表达载体的 CMV启动子和 RSV启动子下游(pRSC-HBV/HCV),转染SP2/0细胞,通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达,免疫Balb/c 小鼠,用酶联免疫法[ELISA]检测血清抗-HBc及抗-HCV抗体的转换,通过LDH释放法观察小鼠脾细胞对表达HBcAg及HCV核蛋白的SP2/0细胞的特异性杀伤活性,并通过荷瘤试验观察小鼠注射表达HBcAg及HCV核蛋白的SP2/0细胞后肿瘤生长情况以判断体内CTL活性。 2.通过PCR扩增在HBV核心区3’端引入4个拷贝的CpG序列,定向克隆于卡拉霉素抗性基因的 VR1012为载体(V-HBc/CpG)。同时从质粒pcDNA-HBV经酶切,回收其中1KB的不含CpG序列的HBV核心区基因,定向克隆于V-1012(V-HBc)。并人工合成硫代修饰的免疫刺激DNA寡核苷酸[CpG ODN]及非免疫刺激寡核苷酸[非CpG ODN],分组免疫Balb/c小鼠,用ELISA检测血清抗-HBc抗体的转换,通过LDH释放法观察小鼠脾细胞对表达HBcAg的SP2/0细胞的特异性杀伤活性,并通过荷瘤试验观察小鼠注射表达HBcAg的SP2/0细胞后肿瘤生长情况以判断体内CTL活性。 3.用CpG ODN与HBV S区基因真核表达载体(V-HBs)联合免疫HBsAg转基因鼠,用ELISA观察小鼠血清HBsAg及抗体转换,通过免疫组化 [SP法]、病理HE染色及电镜观察小鼠肝组织HBsAg表达量的改变、肝组织炎症活动度及超微结构的变化。 结果:1.pRSC-HBV/HCV转染SP2/0细胞可见游离 HBcAg及HCV核蛋白的表达,5只免疫鼠中全部出现抗一HCV及抗一HBV抗体,小鼠脾细胞对转染pRSC-HBV/HCV的SPZ/0细胞的特异性细胞毒活性为sl%,明显高于空载对照组,荷瘤试验显示免疫组小鼠注射转染pRSC-HBV/HCV的驴/0细胞2周时肿瘤平均直径为7.25土 豆.15mm,明显小于空载对照组小鼠肿瘤直径门.85士0.25mm),二者差异显著 (P<0.05)。注射肿瘤细胞后3周,2只pRSC-HCV/HBV免疫组小鼠仍然存活,而对 照组则全部死亡。 2.免疫刺激DNA序列联合基因免疫实验显示,V-HBC+CPG ODN组及V一 HBC/CpG组免疫鼠脾细胞对转染pRSC-HBV的SP2/0细胞的特异性细胞毒活性分别 为 18%、60%,均高于 V-HBC+非 CpG ODN组及 V-HBC对照组。荷瘤试验显示 V 一mc联合 CpG ODN组及 V一HBc/CpG在免疫 2周时肿瘤直径分另为 5.8 f 0.l恤。 4.85士0.75mm,明显小于 V-HBC联合非 CPG ODN及 V-HBC对照组门.85土0.65、 19.05士0.75j,差异显著(P<0.05)。注射肿瘤细胞后 3周,V一HBC联合 CPG ODN 组及 V-HBc/CpG免疫组小鼠仍然存活,而对照组全部死亡。 3.在HBV转基因鼠的抗病毒实验显示,V-HBS联合CpG ODN组6只免疫鼠中 有2只血清抗一ms抗体阳性,其平均效价为56.21士15.16mIWml,高于免疫保护 所需的最低水平(10ml/ml),血清HBsAg浓度在免疫后第8周时明显降低,并 有2只转阴,而单用V-HBS组及V-1012对照组小鼠血清抗一HBS抗体均阴性、 HBsAg含量无明显降低。V-HBs+CpG ODN组肝组织 HBsAg的表达量低于 V-HBs组及 对照组,差异显著(P<0.05)。V-HBS联合CPG ODN组肝组织病理及电镜观察可见 大量炎细胞浸润,炎症组织活动度积分明显高于V-HBS组及对照组。 结论:PRSC一HBV/HCV在Balb *小鼠可同时诱导对HBV及HCV的体液免疫应答 及细胞免疫应答,提示真核双表达载体可用于构建联合基因疫苗,该研究为HBV/HCV 联合基因免疫探索了新的策略。CpG ODN联合V-HBc及V一HBc/CpG在Balb/c体内 可增强其特异性的细胞免疫应答,进一步在 HBV转基因鼠的实验研究显示,CPG ODN 联合 V-HBS可增强其免疫应答及抗病毒效应。该实验证实 CpG ODN联合基因兔疫可 增强机体的免疫应答及抗HBV效应,为打破慢性乙型肝炎免疫耐受及基因兔疫治疗 探索了新的方法。