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目的:
本研究旨在探讨人Tenons囊成纤维细胞在转化生长因子beta2(TGF-β2)的刺激下其低密度脂蛋白受体(LDLr)的动态变化以及对低密度脂蛋白(LDL)的结合和内吞。
方法:
1.人Tenons囊成纤维细胞的体外培养及鉴定:取角膜移植供体眼球的Tenons囊组织,采用组织块体外培养法体外培养成纤维细胞;免疫荧光法鉴定所培养的细胞是否表达成纤维细胞的特征性抗原。
2.以不同浓度(0 ng/ml、0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、1.0 ng/ml、5.0 ng/ml、10ng/ml)的TGF-β2分别刺激人Tenons囊成纤维细胞24 h、48 h和72 h。
3.以MTT法分别检测各时间点各刺激浓度下人Tenons囊成纤维细胞的增殖率变化。
4.用实时定量RT-PCR定量分析各时间点各刺激浓度下人Tenons囊成纤维细胞的LDLr的mRNA水平的变化。
5.以Western blot定量分析各时间点各刺激浓度下人Tenons囊成纤维细胞的LDLr的蛋白水平。
6.以密度梯度离心法自健康志愿者血浆中提取LDL,并以DiO标记。
7.以荧光共聚焦显微镜观察和评估活的人Tenons囊成纤维细胞与DiO标记的LDL的结合与内吞过程,并进行荧光定量分析。
结果:
1.成功进行了人Tenons囊成纤维细胞的体外培养,观察到传代3~6代的细胞呈长梭形,核较大,胞浆丰富,呈漩涡状排列生长,增殖能力强。免疫荧光法检测Vimentin、Fibronectin染色阳性。
2.MTT法检测发现在不同浓度的TGF-β2以不同时间刺激下,人Tenons囊成纤维细胞的增殖率呈浓度依赖性和时间依赖性,其增殖高峰出现在刺激浓度为1.0ng/ml刺激时间为72 h。
3.实时定量RT-PCR和Western blot显示相似的结果,人Tenons囊成纤维细胞在TGF-β2刺激下其mRNA和蛋白水平的表达呈现浓度依赖性和时间依赖性,并且其峰值都出现在刺激浓度为1.0ng/ml刺激时间为72 h。
4.线性相关分析发现在TGF-β2刺激下,人Tenons囊成纤维细胞上的LDLr的表达(mRNA和蛋白)和细胞增殖呈高度相关。
5.荧光共聚焦显微镜显示其与DiO-LDL的结合和内吞呈现时间依赖性,且在6h时达到饱和,荧光定量分析显示TGF-β2刺激组和空白对照组有显著性差异。
结论:
本研究显示在TGF-β2刺激下出现异常增殖活跃的人Tenons囊成纤维细胞其LDLr高表达且呈现浓度依赖性和时间依赖性。并且,该结果提示异常增殖活跃的Tenons囊成纤维细胞上的LDLr有可能成为一种药物控释系统的新型靶点,尤其应用在结膜创伤修复中抗瘢痕化治疗方面。