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1．玉米尿卟啉原甲基化酶的功能片段的确定依赖于S-腺苷甲硫氨酸的尿卟啉原甲基化酶（S-adenosyl-L-methionine：uroporphyrinogen methyltransferase，SUMT）是微生物合成西罗血红素、血红素d1、F430因子和维生素B12等卟吩烷类化合物的重要调控酶，植物中SUMT负责西罗血红素生物合成的调控。SUMT催化尿卟啉原Ⅲ在C2和C7位的甲基化，大肠杆菌重组表达的SUMT会在细胞中积累西罗叶绿三酸和过甲基化产物三甲基咕啉，它们在紫外光下产生强烈红色荧光，这种性质可用于检测SUMT在重组系统的体内酶活。利用不同的限制性内酶切，将编码玉米SUMT的基因切成不同片段，分别插入不同的表达载体中，表达的蛋白分别是玉米SUMT，含有叶绿体导肽的SUMT前体，切除SUMT的N端S-腺苷甲硫氨酸结合模块的截头突变体，和切除SUMT的C端52个氨基酸残基的截尾突变体。其中，SUMT和截尾突变体N端含有组氨酸标签。将所有重组表达载体转化大肠杆菌JM109，结果显示表达融合叶绿体导肽的SUMT前体和截头突变体的重组大肠杆菌菌落没有红色荧光。蛋白检测显示表达的重组蛋白为包涵体，表明叶绿体导肽和SAM结合模块影响酶在大肠杆菌中的折叠。而表达SUMT的N端分别融合表达一段13个氨基酸残基的寡肽、或组氨酸标签，或麦芽糖结合蛋白，重组大肠杆菌菌落显示红色荧光；表达截尾突变体的重组菌落显示红色荧光，表明SUMT的C端52个氨基酸残基对酶活没有显著作用。分别将表达玉米SUMT和截尾突变体的表达质粒转化大肠杆菌S13009，诱导表达，利用Ni-NTA层析一步纯化了玉米SUMT及截尾突变体，纯度在90％以上。玉米SUMT的亚基分子量在SDS-PAGE上测定约34 kD，凝胶层析测得全酶分子量为52 kD，动态光散射测定全酶分子量约79 kD，表明玉米SUMT是同亚基二聚体。纯化的蛋白结合红色荧光色素。从纯化的玉米SUMT中分离色素，利用紫外-可见光谱和荧光光谱确定酶结合色素的主要成分是三甲基咕啉，而玉米SUMT氨基酸残基干扰结合色素的荧光激发峰。圆二色性分析表明，去除色素后，玉米SUMT的二级结构有轻微改变，对色素的产生及结合蛋白的可能机制进行了讨论。2．枯草杆菌尿卟啉原脱羧酶的结构研究尿卟啉原脱羧酶（Uroporphyrinogen decarboxylase，UROD）是血红素和叶绿素分支合成的第一个酶，控制着生物体内不同卟啉化合物代谢的流向。它催化尿卟啉原Ⅲ或异构体尿卟啉原Ⅰ四次脱羧产生粪卟啉原Ⅲ或Ⅰ，和一般的脱羧酶不同，UROD不含有辅因子。利用PCR技术从枯草杆菌（Bacillus subtilis）基因组DNA扩增了编码UROD的基因hemE，测序显示编码的UROD有两个氨基酸残基发生改变，分别是Ile155被Thr155取代，Glu198被Lys198取代，扩增产物酶切后插入pET 15b中，表达的枯草杆菌UROD（B．subtilis UROD，bsUROD）N端含有组氨酸标签，将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），Ni-NTA一步纯化，蛋白纯度在90％以上。酶的比活为560 U／mg蛋白。纯化的bsUROD亚基分子量在SDS-PAGE上测定约41kD，动态光散射测定全酶分子量约81 kD，表明bsUROD是同亚基二聚体。利用悬滴法获得bsUROD的晶体，收集到分辨率为2.3（?）的晶体衍射数据，以人UROD的结构作为模型，利用分子置换法解析了bsUROD的晶体结构，晶体空间群为P1，在bsUROD的模型中，一个晶胞中有四个UROD单体，晶胞参数a=58.612（?），b=80.410（?），c=90.940（?），α=68.681°，β=89.638°，γ=80.817°，bsUROD的最终模型的自由R因子和晶体学R因子分别为19.74％和25.13％，键长和键角的RMSD分别为0.012（?）和1.290°。bsUROD的结构已经投入PDB（PDB code：2INF）。解析的bsUROD单体结构包括6-88和101-349氨基酸残基，单体只有一个结构域，由（β／α）8桶折叠组成，酶活中心呈现凹穴结构，利用hUROD和产物粪卟啉Ⅲ的复合物结构，将粪卟啉Ⅲ的结构和bsUROD进行空间叠合，结果显示，bsUROD酶活中心有18个氨基酸残基和粪卟啉Ⅲ有接触，根据对底物的识别和脱羧的功能将它们分为3类。第一类是Asp残基；第二类包含数个极性氨基酸残基；第三类包括数个疏水氨基酸残基。在18个氨基酸残基中，只有Arg29，Arg33，Asp78，Ile79，Phe104，Tyr154，Phe207和His322在30个物种的UROD中是不变的。对它们可能的功能作了讨论。bsUROD和真核生物UROD结构比较发现有两个loop差别很大，这两个loop的构象变化可能涉及底物的结合和产物的释放。由于UROD和SUMT催化相同的底物，推测SUMT结合尿卟啉原吡咯环NH基团的氨基酸残基和bsUROD一致。根据bsUROD和催化产物的模拟结构，我们提出了一种新的催化机制，bsUROD中Arg29可能参与脱羧，而Phe144和／或Phe207可能参与捕获二氧化碳分子。3．参与血红素，西罗血红素和NAD生物合成的酶的纯化及结晶生物中血红素和西罗血红素是个多功能分子，参与它的生物的酶的结构和功能的研究近年来有很大进展。3-羟邻氨基苯甲酸双加氧酶（3-Hydroxyanthranilic acid 3，4-dioxygenase，HAO）是NAD合成途径中关键调控酶。我们分别克隆、表达和纯化了枯草杆菌合成血红素的上游和中游的酶，以及西罗血红素分支合成的酶，收集了两个酶的晶体衍射数据，同时分别克隆、表达和纯化了酿酒酵母合成血红素合成下游两个酶和HAO，收集了HAO的晶体衍射数据，由另一同学解析了结构。根据晶体生长的统计结果，对生物信息技术在蛋白晶体生长的作用，及组氨酸标签在蛋白表达、纯化和晶体生长中的应用、存在问题等作了简要的讨论。