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背景:周围神经缺损在创伤骨科中较为常见,目前对于大段神经缺损主要采用自体神经移植修复,但因其局限性无法在临床中广泛开展。随着组织工程学的发展,利用人工神经修复大段神经缺损有望成为最佳治疗方案。种子细胞即许旺细胞是人工神经研究的核心,由间充质干细胞诱导所得的类许旺细胞相对自体、异体许旺细胞而言具有优越性,因而成为获取许旺细胞的相对较好方式。间充质干细胞来源广泛,如骨髓、脐带、脐血、脂肪等,脐血间充质干细胞具有自身优越性更加吸引研究者。将间充质干细胞诱导为类许旺细胞的过程是通过调节基因表达以实现诱导目的,通过研究诱导过程中的基因表达学特性,如果能在基因表达学转录层面上证明类许旺细胞更接近许旺细胞或了解它们之间的差异,为后期的进一步深入研究提供一定理论依据。 目的:培养人脐血间充质干细胞(HUCBMSCs)、由HUCBMSCs诱导而来的类许旺细胞(类SCs)和许旺细胞(SCs),提取三种细胞mRNA,运用基因芯片技术分析三种细胞的基因在转录水平的表达情况,筛选目的基因,说明诱导后的类SCs比较接近SCs。 方法:沿用本课题组以往采用的红细胞沉降、密度梯度离心法提取、纯化人脐血中的HUCBMSCs,低酶消化、差速贴壁、条件培养基法提取、纯化引产胎儿坐骨神经SCs,并通过细胞形态学观察、流式细胞仪法对其鉴定及纯度测定,达到实验标准后进行下一步实验。沿用本课题组前期优化的诱导方案将第三代HUCBMSCs诱导为类SCs。三种细胞准备完毕后提取各自mRNA,利用基因芯片技术对其表达基因进行分析,先筛选出HUCBMSCs、类SCs之间的差异表达基因,再将这些差异表达基因与SCs表达基因进行匹配筛选出二者表达无差异性基因,最后在二次筛选且为上调的基因中找出对周围神经损伤修复有意义的基因。选取部分基因进行RT-PCR验证。 结果:1)由HUCBMSCs诱导而来的SCs与诱导前的HUCBMSCs相比存在差异表达基因(含诱导后新表达的基因)数为6331个,其中上调基因数为3569个,下调基因数为2762个,这些差异表达基因除细胞自身分化等因素外可能是诱导引起。2)将上述差异表达基因进行GO富集分析,在细胞组分、分子功能、生物过程三大分类中分别占10.4%、21.2%、68.4%,出现显著富集的条目主要集中在G蛋白偶联受体活性等27个条目中。3)将上述差异表达基因与SCs表达基因相匹配,存在无差异表达基因数为2265个,说明经诱导而来的类SCs在基因表达学转录水平方面更接近SCs。4)将上述匹配的基因结果结合相关文献报道综合分析,在匹配的上调基因中找出了6个对神经损伤修复有一定意义的基因,即S100钙结合蛋白β、人胶质细胞源性神经营养因子、纽蛋白、早期生长反应因子2、中文名为蛋白激酶Cα、中文名为蛋白激酶Cη。5)在筛选的6个基因中选取2个进行RT-PCR验证,验证结果与芯片检测结果一致。 结论: 1.本实验进一步验证了本课题组对HUCBMSCs及SCs提取方法的可行性。 2.从本实验检测结果角度看HUCBMSCs经诱导后在基因表达学的转录水平方面更接近SCs。 3.本次实验筛选的6个基因是HUCBMSCs在诱导为类SCs过程中表达上调的基因也是SCs表达的基因,且对周围神经损伤修复有一定意义。这些基因进一步证明了诱导的类SCs与SCs在基因表达学方面具有一定相似性,为后期诱导方案的进一步优化提供一定理论依据。