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生物蜕皮过程受到蜕皮激素调控，Halloween基因编码的蛋白酶在蜕皮激素合成通路中起重要作用。为了探究3个 Halloween基因：spo（CYP307a1）、dib（CYP302a1）、sad（CYP315a1）在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）蜕皮调控中的作用，采用 RT-PCR和 cDNA末端快速扩增技术（RACE），首次在三疣梭子蟹中分别克隆得到 Pt-spo基因（NCBI登录号：KM030021）、Pt-dib基因（NCBI登录号：KM596851）、Pt-sad基因（NCBI登录号：KM880023）。运用实时荧光定量 PCR（qPCR）方法，分析3个 Halloween基因在三疣梭子蟹不同组织和蜕皮周期中表达差异；利用 RNA干扰技术（RNAi），分析3个 Halloween基因被沉默后下游基因表达及蜕皮激素浓度变化情况；采取眼柄切除处理（ESA），探究3个 Halloween基因与蜕皮抑制激素（MIH）之间的作用关系。 本研究主要内容包括：⑴克隆得到3个 Halloween基因全长，其中 Pt-spo、Pt-dib、Pt-sad分别为2200bp、2105bp、3171bp，开放阅读框分别编码520、541、553个氨基酸。经多序列比对分析发现，Pt-Spo与多齿新米虾（Neocaridina denticulate）相似性最高为62％，Pt-Dib与果蝇（Drosophila melanogaster）相似性最高为40%，；Pt-Sad与多齿新米虾（N. denticulate）相似性最高为53%。构建进化树比对分析后发现，Halloween基因编码氨基酸分类符合生物传统亲缘关系，其中 Pt-dib编码的Dib与昆虫的Dib聚为一大类，Pt-sad编码的Sad与冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、果蝇（Drosophila melanogaster）等其它物种 Sad位于同一进化分支中。Dib家族能够与 Sad家族、Shd家族汇集在一个更大的分支，构成了细胞色素线粒体家族。Pt-spo编码的Spo与昆虫的Spo都聚集在 Spo家族分支中，与Phm家族共同汇集到细胞色素第2家族中。⑵qPCR结果显示：3个基因均在 Y器中表达量最高，与其它各组织具有显著性差异，这表明 Halloween基因功能比较单一，与 Y器是甲壳动物合成蜕皮激素主要器官结论一致。对 Halloween基因在三疣梭子蟹蜕皮周期分析发现，Pt-spo表达量在 C期最高，Pt-dib在 D1亚期最高，Pt-sad在 D1、D2亚期表达量达到峰值。3个 Halloween基因表达量高峰依次先后出现，与其处于蜕皮激素合成通路位置顺序相一致，且表达量最高峰都早于蜕皮激素浓度峰值，可以推断三疣梭子蟹3个Halloween基因在蜕皮调控中起重要作用。⑶RNAi实验结果显示：注射 ds-spo后，Pt-spo、Pt-dib、Pt-sad表达量均出现下调;注射 ds-dib后，Pt-spo表达量无显著变化，Pt-dib和 Pt-sad均出现下调；在注射 ds-sad后，Pt-sad基因表达量显著下调，Pt-spo和 Pt-sad则无显著变化。对分别注射3个 Halloween基因 dsRNA的三疣梭子蟹抽取血淋巴，测定蜕皮激素浓度发现，spo组没有显著性变化，dib和 sad组与对照组相比显著降低。表明3个Halloween基因在蜕皮激素合成的调控中可能存在级联关系。⑷眼柄切除（ESA）实验结果显示：Pt-dib和 Pt-sad表达量均出现不同程度上升。其中 Pt-dib表达量在眼柄切除2天后出现显著性升高，Pt-sad表达量在4天后显著性上升，在第8天开始下降。Pt-spo的表达量没有发生显著性变化。对三疣梭子蟹血淋巴中蜕皮激素浓度测定发现，蜕皮激素浓度上升2.5倍达到5.78ng/mL，8天后达到最高峰为14.92ng/mL。表明眼柄中的MIH基因与Pt-dib和Pt-sad存在一定的拮抗作用。