介孔二氧化硅纳米粒子搭载钙磷离子用于牙本质小管封闭和间接盖髓的实验研究

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目的:如何长期有效的治疗牙本质过敏症一直是临床上难以解决的问题。除了以激光治疗为主的物理方法,许多化学药物可以通过在牙本质小管中形成不可溶解的沉淀来达到封闭牙本质小管的目的。目前临床上常用的牙本质小管封闭剂都无法深入的进入到牙本质小管中,无法应对口腔日常酸蚀与磨损的挑战。由于牙本质主要为钙和磷酸盐复合物,所以磷酸盐沉淀方法表现出了牙本质小管封闭潜能。磷酸钙沉淀封闭剂可以在最初的牙本质小管机械性封闭以及长期的再矿化过程中起到双重的作用。封闭牙本质小管,隔离外界刺激,同时也是临床上对间接盖髓剂的要求之一。因此,如何使磷酸盐沉淀深入的进入牙本质小管中来起到封闭作用成为了学者们研究的热点。介孔二氧化硅纳米粒子(mesoporous silica nanoparticles,MSNs)由于其粒径可调、骨架稳定、孔径均匀、比表面积大等特点被认为是药物载体的优先选择,也成为了牙本质过敏症治疗领域的一种新兴材料。在本研究中,我们将钙离子和磷酸根离子分别搭载在MSN表面制成了Ca2+/PO43-@MSNs,以临床常用脱敏剂诺华敏作为对照,评价适宜水粉比例的新材料抵御模拟口腔日常酸蚀与磨损的能力。另外,由于钙磷均有利于矿化,且Ca2+/PO43-@MSNs的高渗透与钙磷缓释特性,使其具有作为间接盖髓剂,起到保护牙髓组织,并促进人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)分化为成牙本质细胞的可能。本研究将评价适宜水粉比例的Ca2+/PO43-@MSNs对hDPSCs的增殖、迁移和成牙本质向分化的能力。方法:1、制作MSNs,使用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察,筛选出适宜直径大小的MSNs。MSNs搭载钙磷离子后利用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察粒子及混合物大小及形态,使用X射线荧光光谱(X-Ray Fluorescence,XRF)分析其化合物组成,并通过X射线能谱检测其元素组成以及元素分布情况。;2、通过SEM观察五个不同浓度Ca2+/PO43-@MSNs匀浆对牙本质小管的封闭情况,使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算不同水粉比浓度处理的牙本质盘的牙本质小管封闭率,筛选出封闭效果最佳的水粉比例。使用最佳水粉比例处理牙本质盘,以诺华敏作对照,评价Ca2+/PO43-@MSNs抵御模拟口腔酸蚀与磨损的能力。3、根据GB/T16886.12-2017检测细胞毒性,筛选Ca2+/PO43-@MSNs体内应用最高浓度。采用CCK-8(cell counting kit-8,CCK-8)方法检测不同浓度Ca2+/PO43-@MSNs对hDPSCs增殖能力的影响,选用最佳浓度培养细胞,通过细胞划痕实验检测Ca2+/PO43-@MSNs对hDPSCs迁移能力的影响,通过实时定量PCR(Real-time PCR)检测hDPSCs成牙本质向分化基因的表达。结果:1、TEM下可见直径为50 nm的MSNs形状规律,大小均一,孔径分布均匀,粒子的分散性能较好。SEM下可见搭载钙磷后粒子直径为1μm左右,1:1混合后粒子间连接紧密,直径为50 nm左右。XRF结果显示钙磷搭载率提高至41.227%与38.976%。EDS结果显示钙磷搭载成功且元素分布均匀;2、Ca2+@MSNs:PO43-@MSNs:H2O=0.015 g:0.015 g:150μL浓度下牙本质小管的封闭效果最佳,可以达到97.6%。相对于目前临床使用的诺华敏,Ca2+/PO43-@MSNs可以更好的抵御口腔日常的磨损与酸蚀。3、0.67mg/mL Ca2+/PO43-@MSNs促进hDPSCs增殖能力最佳。划痕实验显示,0.67mg/mL的Ca2+/PO43-@MSNs有促进hDPSCs迁移的能力。PCR结果显示0.67mg/mL浓度的Ca2+/PO43-@MSNs有促进hDPSCs成牙本质向分化的能力。结论:本实验成功制备完成搭载Ca2+或PO43-的MSNs,即Ca2+@MSNs与PO43-@MSNs两种粒子。筛选出了对牙本质小管封闭效果最佳的水粉比例,且在适宜水粉比例下的Ca2+/PO43-@MSNs相对于临床使用的诺华敏能够更好的抵御日常口腔的酸蚀与磨损。适宜浓度的Ca2+/PO43-@MSNs可以促进hDPSCs的增殖、迁移和成牙本质向分化。这为Ca2+/PO43-@MSNs这种新材料应用于临床奠定了理论基础。
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